RSS订阅

实验方法

艾滋病SIV/SAIDS动物模型的制备方法

2020年07月13日 浏览量: 评论(0) 来源:《常见和新发传染病动物模型》 作者:张连峰 秦川 主编 责任编辑:yjcadmin

一、不同感染途径制备的动物模型

艾滋病传播的三种途径分别是经血液、性和母婴传播。性传播包括同性传播和异性传播两种方式。SIV动物模型的制备首先要考虑其实际应用价值,最好的动物模型可以最大限度地模拟人类疾病,包括使用与自然感染相同或接近的方式建立模型。根据上述主要的自然感染方式,以SIVmac251接种中国恒河猴,可以制备四种不同感染途径的动物模型:

1.血液感染模型  通过静脉途径,病毒直接感染到血液中的CD4+T淋巴细胞,如用1m1 2×100000 TCID50的SIVmac251经静脉缓慢推入猴体内可感染中国恒河猴,成功率高。

2.异性性传播模型  通过阴道黏膜上皮途径感染,病毒可直接感染朗格汉斯细胞、上皮细胞。在AIDS灵长类动物模型的研究中发现体内注入黄体酮可促进SIV传播,而雌激素则抑制SIV传播,可能与这些激素能影响阴道壁厚度或通过IL-2等影响CCR5和CXCR4受体表达有关。在合适的生理周期或使用一定量的黄体酮的情况下,用导管将1ml 2×10的7次方 TCID50的SIVmac251缓慢注入猴阴道内,可建立异性性传播动物模型。

3.同性性传播模型  通过直肠黏膜上皮途径感染,病毒直接感染M细胞、上皮细胞。直肠的生理构造及上皮细胞厚度非常薄等特点,都使直肠感染较阴道感染容易发生。用1ml 2×10的7次方 TCID50的SIVmac251缓慢注入猴直肠内,可建立同性性传播动物模型。采取一定时间内小剂量多次感染方式,一般经过5~8次感染,能达到100%感染。

4.母婴传播模型  近年来,用SIV接种新生恒河猴建立了新生儿AIDS动物模型,观察到了与HIV感染的婴儿相似的症状,如果使用毒力强的SIV毒株,新生恒河猴的疾病进程进展非常快,该模型在研究婴儿感染HIV的疾病特征和治疗方面有实用价值。有学者发现感染猴艾滋病的母猴,生产的小猴患有艾滋病,这是最理想的母婴传播动物模型,但由于不易得到,使其应用受到限制。

值得注意的是,病毒经静脉、阴道和直肠途径感染的效应细胞不同,静脉接种是直接感染CD4+T细胞;阴道中是感染朗格汉斯细胞、上皮细胞;直肠是M细胞、上皮细胞。直肠和阴道黏膜的构造也不相同,阴道主要是鳞状上皮细胞,直肠主要是柱状上皮细胞,阴道上皮细胞的厚度是直肠上皮细胞的十几倍。病毒在不同的感染途径,受到来自机体的免疫压力也不尽相同,因而,不同的感染途径在临床表现、病毒学指标以及其他方面存在一定的影响。

二、SIV/SAIDS动物模型的制备

(一)SIV/SAIDS 动物模型的制备材料和方法

1.实验用病毒  感染毒株为SIVmac251或SIVmac239,病毒原液TCID50为2×10的7次方/ml。

2.实验动物  选用体重4~6kg的SPF恒河猴,排除猴免疫缺陷病毒(SIV)、猴反转录D型病毒(SRV-1,2,5)和猴T淋巴细胞性Ⅰ型病毒(STLV-1)的感染。如有可能,进行动物遗传背景分析。实验前体检无异常。动物的感染实验必须在ABSL-3室中进行。

3.SIVmac251病毒的接种  通过静脉、阴道、直肠三种途径感染恒河猴,感染剂量和方法分别为:①静脉途径。用1ml 1:100稀释病毒液,经静脉缓慢注射入体内;②阴道途径。用1ml病毒原液,动物俯卧位,缓慢将病毒液注入阴道末端处,保持俯卧位半小时;③直肠途径。用1ml病毒原液,动物俯卧位,缓慢将病毒液注入肛窦处,保持俯卧位半小时。

4.全血病毒分离  在病毒接种后4d、7d、10d、14d、21d、28d及其他有意义的时间点,采集SIV感染恒河猴肝素抗凝全血,进行全血病毒分离。具体步骤如下:取24孔板,用10%牛血清1640培养基对全血标本进行5倍系列稀释。稀释后,每孔最终含全血标本量分别为200μl、40μl、8μl、1.6μl、0.32μl和0.O64μl。每孔加入浓度为2×100000/ml的CEMx174细胞0.4ml,最后用含10%牛血清1640培养基补足至每孔1.6ml,置37℃,5%CO2孵箱培养,每隔3~4d换液一次。每天观察CPE,连续观察4周,能出现CPE的最高稀释度为该标本的病毒效价。

5. PBMC病毒分离  在病毒接种后4d、7d、10d、14d、21d、28d及其他有意义的时间点,分别采集SIV感染恒河猴肝素抗凝全血和正常猴(无SIV、STLV-1、SRV和B病毒感染)肝素抗凝全血,密度梯度离心分离PBMCs,计数,调细胞浓度为1×1000 000/ml。正常猴PBMC用PHA(终浓度5μg/ml)刺激,SIV感染猴PBMC用IL-2(终浓度100U/ml)和PHA(终浓度5μg/ml)刺激,置37℃,5%CO2培养箱培养3d。3d后,将正常猴和感染猴PBMC各1ml混合培养于24孔板上,更换含IL-2(25U/ml)和10%牛血清的1640培养基。每天观察细胞形态变化(CPE)和生长状态。如细胞数量减少,状态不好,可适当添补新鲜的生长良好的正常猴PBMC。每隔3~4d吸取培养上清,用ELISA方法测定P27抗原,并补充新鲜1640培养基至终体积1.6ml,置37℃,5%CO2培养箱继续培养。细胞培养至4周。

6.病毒载量检测  用SYBR GreenⅠ荧光染料实时定量RT-PCR方法测定病毒载量。具体步骤为:EDTA抗凝的全血,离心取上清,TRIzol法提取病毒RNA,使用Qiagen的 QuantiTect SYBR Green RT-PCR试剂盒,Roche LightCycler3.5 real-time PCR仪器进行测定。引物:2f(5'-GTAACTATGTCCACCTGCCATTA-3')  和2r(5'-CAGCCTCCTCGTTTATGATGT-3'),所扩增片段长度为209bp。反应体系为:2×QuantiTect SYBR Green I RT-PCR Master Mix 10μl;引物2f、2r(10μmol/L)各1μl,终浓度为0.5μmol/L;QuantiTect RT Mix 0.2μl;模板1μl;PCR级水6.8μl。反应条件为:50℃20min(×1),95℃10min(×1),94℃15s(×45),56℃20s(×45),72℃30s(×45),75℃3s(×45)测定吸光值。

7.CD4+/CD8+ T淋巴细胞测定  取EDTA抗凝全血50μl加入PerCP-CD3/FITC-CD4/ PE-CD8荧光标记抗体各10μl,轻轻混匀,室温避光保存15min;10倍稀释的FACS Lysing SouLution 1ml避光10min,裂解红细胞。流式专用PBS洗2遍,加入0.5ml 1%多聚甲醛,放4℃冰箱保存,48h内上机检测,测定淋巴细胞中CD4+及CD8+T细胞的百分数,计算 CD4+/CD8+比例。

8.血浆抗体测定  免疫荧光法(IFA)检测感染猴血浆中的抗体水平。用SIVmac251感染CEMx174,制备抗原片。首先将待检标本1:20稀释,对倍系列稀释至1:1280,分别滴加到抗原片上,在37℃湿盒中反应30min,使抗原抗体充分结合,然后洗涤,除去未结合的血清成分。加上FITC荧光标记的抗猴IgG抗体,在湿盒中37℃反应30min,洗涤,荧光镜下观察结果。

9.细胞免疫测定(Elispot)  预先用抗猴IFN-γ抗体包被96孔平板,4℃过夜,后用含0.05%吐温-20的PBS(PBST)洗板,加入含1%BSA的PBS 200μl 37℃封闭1h。用 Ficoll密度梯度离心法分离猴PBMCs,计数并用无血清培养液调整细胞浓度为3×1000 000/ml,将PBMC加入封闭好的96孔板孔中,每孔加入细胞液100μl,并每孔加入5ng的多肽刺激,37℃5%CO2培养箱孵育24h。孵育结束后,把细胞液倒出,用200μl的冰冷去离子水处理,后用PBST洗板10次,之后,先后加入生物素化的检测抗体和GABA结合的抗生物素抗体孵育37℃1h。孵育结束后,用PBST洗板5次。后加入底物室温显色15~20min,显色完毕,用蒸馏水洗板两次,干燥,避光保存。做好的ELISPOT板通过倒置显微镜和 ELISPOT读板仪读板计数。

10.中和抗体的测定  将待检血清系列稀释,将稀释好的血清与一定量的病毒液于37℃孵育一小时,后用中和液进行TZM-bl细胞感染,观察感染情况,从而判定血清半数中和浓度。

(二)艾滋病SIV/SAIDS动物模型评价规范

1.临床评价规范  实验猴在感染后7~14d出现食欲减退,并持续两周以上时间,体重有所下降,腹股沟等处浅表淋巴结可触及肿大。感染后半年,感染猴出现明显食欲减退,体重下降,腹泻,腹股沟淋巴结变小、体表多处感染红肿,动物因耗竭而死亡,以静脉感染为甚。由于动物个体差异不同,疾病的程度和临床过程、表现不尽相同,有时AIDS症状不十分典型。

2.病原学评价规范  病毒分离结果发现,一般感染后7d,在三种途径实验猴全血中均能分离到病毒,病毒分离高峰出现在感染后10~40d,以后全血病毒效价迅速下降,维持低水平状态。血浆病毒载量的检测可发现感染后3种途径变化趋势基本一致,感染后迅速上升,在14d左右可达到10的7次方copies/ml以上,维持40d左右,以后迅速下降。一般静脉感染猴病毒检出较早,其次为直肠感染猴,最后是阴道感染猴,急性期过后,猴的病毒载量出现一定的波动,病毒Gag P27抗原检测在急性期很容易检测到。

3.免疫学评价规范

(1)细胞学变化:CD4+/CD8+比值在实验猴感染后7d开始下降,并出现倒置,这种现象可持续较长时间。在整个感染后期CD4+/CD8+比值在1或以下上下波动。

(2)体液免疫变化:抗体检测可发现感染猴最早在第10~14d时检出阳性,随后抗体效价平缓上升,直到第40天~24周时达高峰;以后下降,一直维持存在。

(3)细胞免疫变化:感染猴的IFN-γ水平呈反复的上升下降的现象。感染初期,实验猴PBMC中分泌IFN-γ的细胞(SFC)数均较低,感染后30d后出现了一个小高峰,随后进入平台期,实验猴的SFC数稳定在100个上下,在感染后的第126天出现另一个高峰,随后降低进入波动期,SFC均值在(100~200)个/1000000 PBMC的水平之间波动。

(4)病理学变化:SIV在体内建立长期慢性感染后,随着疾病的进展,可影响到机体各个系统的功能、形态,最终呈现出复杂多样的病理学改变。另一方面,各系统脏器损伤——如淋巴组织的破坏、造血组织的破坏等,也参与到了AIDS形成的进程之中。观察研究SIV感染猴模型上在病理学上的改变,有助于了解模型的发病机制,进一步对模型的可用性加以评价。

三、艾滋病SHIV/SAIDS恒河猴模型制备

SHIV病毒,是以SIV病毒为骨架,与HIV-1病毒的基因重组而成的人工嵌合病毒。它以SIV的基因组为背景表达嵌入的HIV的基因成分,克服了HIV与SIV在包膜结构和抗原性之间存在的较大差异,克服了以SIV感染动物模型评价HIV疫苗和药物时,由于毒种差异造成了该模型在使用中的局限性和评价的准确性。因此,SHIV感染模型较SIV感染模型前进了一大步。理论上,SHIV感染猴模型应该是目前最好的艾滋病动物模型,但这些合成的SHIV大多不能像SIV那样引起典型的猴艾滋病,目前在国际上报道成功建立了SHIV感染动物模型的毒株有SHIV-SF162、SHIV-89.6P和SHIV-HXBc2等株,这些SHIV毒株在猪尾猴体内传代后,可持续性高水平复制,并引起CD4+T细胞的丢失,终因机会性感染引起死亡。

目前绝大部分的SHIV是基于HIV-1 B亚型毒株的基础上构建的,如SHIV-89.6就是这样的一个嵌合病毒,是SIVmac239为主体,携带有HIV-1 B亚型的env基因。SHIV-89.6的亲本株HIV-1 89.6是双嗜性毒株,具有T淋巴细胞和巨噬细胞嗜性。表达HIV-1 89.6的 tat、rev、vpu和env基因的SHIV-89.6虽然能感染恒河猴,但并不会使猴子产生类似于 AIDS的症状,经过多次猴体内连续传代实验后,其env区发生了140个碱基的缺失,gp120和gp41的膜外区域部分有12个氨基酸发生了改变,产生强致病株SHIV-89.6P,该传代致病株可迅速降低CD4+T淋巴细胞,使印度恒河猴产生类似于AIDS的症状。SHIV-KB9是 SHIV-89.6P的一个克隆株。国外动物实验证明SHIV—KB9对印度恒河猴和食蟹猴具有较强的致病性,是较成熟的SHIV病毒之一,近年来在国外广泛应用于艾滋病致病机制研究及 HIV疫苗评价工作。我国学者也构建了以中国流行HIV-1 B'/C株为嵌入的SHIV病毒株,并进行了中国恒河猴的感染实验,证实能有效感染,出现病毒血症和淋巴细胞改变等。

为建立SHIV恒河猴动物模型,首先明确SHIV的感染剂量是非常必要的。感染剂量太少将不能使恒河猴感染上SHIV病毒,太多则可能使恒河猴迅速死亡,一般要求先用实验用猴滴定病毒浓度,确定感染剂量。Reimann等人用400 TCID50剂量的SHIV-HXBc2和SHIV-89.6感染印度恒河猴,获得了成功。4.8×100 000 copies/ml及以上浓度的SHIV-KB9病毒液能成功感染中国恒河猴。SHIV也主要通过三种感染途径:静脉途径感染,黏膜途径感染(包括阴道途径和直肠途径)和母婴途径感染,分别模拟人感染HIV的血液传播、性接触和母婴传播。目前,绝大部分研究的重点放在静脉途径和黏膜途径,静脉感染一般用于研究 HIV疫苗和抗HIV药物的效果及机制,常用的SHIV毒株有SHIV-89.6P和SHIV-KB9;而黏膜感染常用于研究黏膜免疫的机制及疫苗或药物的效果,常用毒株有SHIV-sfl62P3和 SHIV-1157i等。

1. SHIV/SAIDS动物模型的制备材料和方法  目前国内的SHIV毒株非常少,处于实验阶段。SHIV-89.6P病毒比较成熟,可由美国NIH引进。动物恒河猴以及其他检测指标和上面SIV介绍相同。

2、SHIV/SAIDS动物模型评价规范  不同的SHIV毒株,其感染的实验用猴的临床表现、病毒血症、淋巴细胞改变和疾病程度会有很大不同。SHIV-89.6P病毒感染后,动物会出现厌食、烦躁不安、水样腹泻、体重减轻及消瘦、甚至死亡等症状和体征。ELISA方法测定实验猴血浆中的P27抗原,在感染后10~14d开始为阳性,病毒分离7~10d后呈阳性,血浆病毒载量一般从第7d开始出现阳性,第10~21天病毒载量达到高峰(1.0×10的7次方copies/ml以上),而后持续下降,在较长时间内有时检出阳性,有时不易检出。感染前实验猴的CD4+/CD8+比值均大于1,感染后10~21d逐渐下降、倒置,持续时间不等,有时会有出现倒置、正常交替的现象。病毒感染前,实验猴的CD4+T细胞绝对数都在1000个/微升以上。感染后实验猴的CD4+细胞数都迅速下降,一般在第14~21天降至最低点,以后可持续维持低水平,也有不稳定波动现象。


点击这里给我发消息 点击这里给我发消息 点击这里给我发消息