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实验方法

微卫星DNA分子标记及其应用

2020年08月25日 浏览量: 评论(0) 来源:《遗传标记在实验动物遗传质量控制中的应用》 作者:宋国华 责任编辑:yjcadmin

分子遗传标记的研究一直是遗传学研究中的一个热点。在各种分子遗传标记中,微卫星DNA标记以其特异性的扩增、稳定性、重复性好、能较好地反映物种的遗传结构和遗传多样性变化等待点,被作为理想的遗传标记,在动物遗传分析研究中已经得到了广泛的应用,受到许多学者的青睐。

一、微卫星序列及其产生机制

微卫星(microsatellite)又称简单序列重复(simple sequence repeats, SSR),是指以少数几个核苷酸(一般为1~6个)经多次重复单位组成的简单多次串联重复序列,如(CA)n、(TG)n等;又被称为短串联重复序列。简单序列重复其长度大多在100bp以内。根据微卫星的结构,Weber(1991)等将其分为3类,即完全的(perfect)、不完全的(imperfect)和复合的(compound)微卫星。完全的微卫星是指由不中断的重复单位构成的微卫星;不完全的微卫星其重复序列中间有3个以下的非重复碱基,两侧不中断的部分重复数大于3;复合的微卫星则指两类或两类以上的串联重复单位由3个连续的非重复碱基分隔开,但不中断的重复单位的重复数不小于5。

关于微卫星的产生机制,普遍认为是DNA复制过程中滑移,或DNA复制和修复时滑移链与互补链碱基错配,导致一个或几个重复单位的插入或缺失。该假说认为,微卫星序列在复制过程中新生链和模板链之间有时会发生局部解链和重新配对。重新配对时,新生链和模板链偶尔错位而产生错配,DNA聚合酶在这种错配的DNA链上继续合成,就会导致新生链的长度发生变化,并可导致微卫星DNA的长度发生变化。如果这种错配不被体内的DNA复制系统正确修复,下一轮复制时就可以产生序列长度突变的双链DNA。错配修复基因超家族属于管家基因,它们可查出并纠正DNA复制及DNA损伤过程中出现的未配或错配的碱基,控制复制和重组的精确性。该基因家族的突变将导致表型突变,表现为MI增加以及活性基因的高突变。

微卫星多态性是微卫星不稳定性的表现。微卫星多态性表现于同一微卫星位点在不同个体之间以及同一个体的正常组织与某些异常组织之间,微卫星位点的重复单位的数目不同。微卫星序列基本重复单位的长度与序列的突变率成正相关,并且这种相关性不是简单的线性关系。微卫星序列基本重复单位的长度也与序列的突变频率有关。离体复制时,二碱基微卫星序列的突变序列的突变频率显著高于三碱基微卫星序列。有关体内的情况,目前尚有较大的争议,由于研究方法不同得出的结论各不相同。

尽管微卫星在进化上是一类中性的分子遗传标记,但现在发现微卫星DNA在基因组中具有非常重要的功能和作用。主要有以下几种功能:微卫星作用于染色质组织,包括染色体组织、DNA结构、着丝粒和端粒等;微卫星调节DNA代谢,包括 DNA复制、DNA重组、MMR错配修复系统和细胞周期的调节;微卫星可以调节基因活性,包括基因转录、蛋白质结合和基因翻译的调节,如图5-1所示。

二、微卫星标记技术的一般流程

微卫星分析的关键在于开发基因组中某个微卫星两侧的引物序列。如果有现成的微卫星引物,在PCR扩增后,即可利用电泳技术进行分析。以下根据流程的先后,分4个步骤进行介绍,前两步是为开发新的微卫星引物所必需的。一般的实验室应用已知的微卫星引物进行多态性分析,只需掌握后两步即可。

1.微卫星序列的获得  微卫星序列的获得是微卫星分析的第一步,也是最复杂的一步。在使用微卫星方法之前,如何获得所需要的微卫星位点大致有4条途径:①寻找已存在的微卫星引物;②使用与所研究物种亲缘关系较近物种的引物;③用经典分子生物学方法克隆所需要的微卫星位点;④从RAPD标记中获得微卫星DNA。

(1)通过检索GenBank、EMBL和DDBJ等DNA序列数据库:这种搜索微卫星序列的方法简便、易行,随着公布的DNA序列越来越多,人们可以从互联网上获得含有微卫星的序列。这一方法可以省去构建基因组文库、杂交、测序等烦琐的工作,但所获得的微卫星信息不如基因组文库。如Akagi(2001)从DDBJ数据库中搜索了11798个水稻序列,找到了369个微卫星。而从水稻基因组文库中估计则有5700个微卫星。

(2)使用与所研究物种亲缘关系较近物种的引物:微卫星潜在价值的特征是从一个物种产生的引物可以应用于相关的分类群,而小卫星不具有这一特征。如在一种鲸基因库中确认的微卫星位点的PCR引物已经成功地应用于许多其他相关物种中;一些人类的引物可应用于非人灵长类动物等。Sun等(1996)根据已知人的8个微卫星DNA序列,用其引物扩增猪和牛的基因,并以生物素标记(CA)12寡核苷酸探针作Southern杂交,检测微卫星DNA顺序的存在,对含有微卫星DNA的片段进行克隆及测序,比较其DNA片段与相应的牛、猪DNA片段的同源性,此研究结果证明,保守微卫星DNA序列的筛选是比较其基因制图的特殊遗传标记的有用途径。

(3)从基因组文库中获得含有微卫星的阳性克隆:首先构建某种生物的小片段(300~800bp)插入文库,再用含有特定微卫星序列的探针去筛选这一文库中的阳性克隆,随后对这些阳性克隆进行序列测定即可。为了提高筛选效率,可以构建富含微卫星的小片段基因组文库,Karagyozqov等在筛选小鼠小片段插入文库含poly(CA)n的克隆时,经过两次富集,阳性克隆从1%提高到40%。为了减少测序的工作量,有必要对所有的阳性克隆进行预检测,即通过PCR扩增去除那些空载体或插入片段不在要求范围内的克隆,也可通过设计引物排除那些微卫星序列在插入位点附近的克隆,因这些克隆无法确定微卫星两侧的保守序列。如张亚平等用(CA)15作探针,获得了大熊猫的10个微卫星。为了摸索一套筛选鲤鱼微卫星的方法,并进一步丰富已经获得的鲤鱼遗传连锁图谱,魏东旺等通过构建鲤鱼基因文库,利用(CA)15作为探针,筛选了22个微卫星,在测定DNA序列的基础上,设计并合成了其中17个微卫星的引物,这些引物在鲤鱼中均能扩增出目的条带。

(4)从RAPD标记中获得微卫星DNA:首先按RAPD方法对某一物种的基因组DNA进行PCR反应,扩增产物经电泳后转移到硝酸纤维素膜上,用某一重复序列作为探针与其进行杂交。确定产生信号的位置,然后从电泳胶上找出相应的片段进行分离、纯化、测序,即可获得这一物种的微卫星DNA序列。这种方法可能需要进行多个随机引物的PCR反应及Southern杂交的操作。

2.微卫星引物的设计  由于微卫星两侧的序列在同一物种间是高度保守的,即可据此设计引物,用以扩增同一物种,甚至不同物种其他基因型的微卫星片段。微卫星引物设计的原则同一般PCR扩增引物的设计,简单地讲,微卫星重复序列两侧的引物在基因组内应具有高度的专一性。每条引物一般为18~24个核苷酸。(G+C)%含量接近50%(Tm值为60℃左右),避免引物内二级结构的产生及某个核苷酸的连续出现。3'末端最好富含GC,PCR的扩增产物在100~300bp之间。

3.PCR扩增  设计引物,进行微卫星特异性扩增,其重现性和稳定性都较好。但由于每对引物的(G+C)%含量不同、扩增产物的长度有异,因此,有必要给每对引物摸索一个合适的扩增条件。一般可通过改变退火温度、缓冲液中Mg2+的浓度及循环数来获得清晰可靠的条带。Tautz在讨论这一问题时指出,当第一对引物扩增到后期时,可通过加入另一个与目标序列互补的引物来去除那些由于引物与其他位点的同源性而产生的非相关扩增条带。但他同时也指出,尽管通过多次预实验来改变反应条件,也不能完全避免某些PCR扩增所带来的假带。

4.扩增产物进行检测  在SSR-PCR扩增以后,要对扩增产物进行检测。一般用聚丙烯酰胺凝胶电泳或者特殊的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。利用银染来检测扩增产物,可避免操作放射性核素的危险,也不会降低灵敏度。银染的分辨率很高,能检测出1ng以下的DNA。用聚丙烯酰胺凝胶电泳对扩增产物进行检测时,通常PCR产物在变性聚丙烯酰胺序列胶上的分离效果优于非变性胶上的分离效果。因为杂合个体在PCR后期的循环中会产生异源双链分子,导致在杂合的情况下胶中产生了3条带甚至是4条带,而不是正常的两条带。这种情况出现会干扰等位基因的统计。SSR-PCR扩增产物在5%~8%(质量浓度)的变性聚丙烯酰胺序列胶上分离后,微卫星DNA中1~2个核苷酸的变化可以分辨出来。每个PCR反应物占据1个电泳泳道,进行序列胶电泳时使用的上样梳具有25~30个样孔,因此每板电泳可同时分析25~50个个体中等位基因的精确变化,这种方法适于作群体遗传的研究。但聚丙烯酰胺凝胶电泳操作起来总没有琼脂糖凝胶电泳那样得心应手。Wu等在检测水稻13个微卫星的多态性时,有3个经过4%的琼脂糖凝胶电泳在两个亲本间找到了多态。

5.数据分析  微卫星位点可以提供大量的信息,对少量的数据分析,可以直接进行计算和比对;对于大群体的分析,Fst和相关的方法是建立在突变率相对低的基础上,明显不适应于微卫星分析。因此产生了新的考虑微卫星高突变率的方法,而且随着计算机技术的发展,出现了一些专门的应用软件。如Quelle讨论了 Grafen's相关统计,并且在Macintosh程序下运行,可以用来计算群体间、特定的个体间的遗传关系。专为微卫星分析设计的MICROSAT是一个多功能软件,包括共享等位基因比率的计算和基因距离间的测量。

三、微卫星标记的特点

1.用微卫星作为遗传标记与其他分子标记相比具有如下优点

(1)分布广泛:微卫星广泛分布于真核生物基因组中,不仅存在于内含子或非编码区,也存在于编码区及染色体上的其他任一区域,每隔10~50kb就存在1个微卫星。例如,猪基因组中存在着65000~100000拷贝的二核苷酸重复单位AC/TG,平均每隔30~50kb就有1个。它的这一特点为在整个基因组中定位更多的基因提供了极大的方便。这是其他方法所远远不及的。小卫星DNA作为遗传标记,虽然也具有重复单位种类多、重复次数有高度个体特异性、多态信息量(polymorphic information content, PIC)大(0.7~0.9)等优点,但与微卫星DNA相比最大的缺点是小卫星DNA一般只分布在染色体着丝粒或端粒区域。因而,利用小卫星DNA只能检测有限个位点。

(2)微卫星DNA具有丰富的多态性:微卫星DNA本身重复单位数的变异是形成微卫星位点多态性的基础。这一特点也是RFLP和RAPD不能相比的。对于 RFLP来说,它主要是由于碱基突变导致限制性酶切位点的丢失或获得,所以大多数RFLP表现为二态性,杂合度低于50%,所提供的信息含量低,多态信息含量仅为0.2左右。而RAPD仅表现出显性遗传,故不能直接区分杂合子和纯合子。就多态性的丰富程度来说,只有小卫星DNA可与微卫星DNA相比,这两者互相补充,将可满足基因连锁分析中对高多态性遗传标记的需要。在不同的个体中,微卫星重复单位数目的变异非常大,由此而造成了高度的长度多态性,并使其具有较高的信息。Dallas与Edwards等(1990)估计微卫星位点的突变率在1×10的-4次方~5×10的-6次方之间。因此,微卫星具有较高的多态性,但其突变率却低于10的-4次方,这在两者之间便有了一个很好的平衡。

(3)等位基因与基因型检测方法简便:一个高度多态序列的等位基因小于500bp并且变动范围窄,则可以用PCR结合凝胶电泳法检测,因而微卫星序列就很好地符合了上述标准。微卫星PCR扩增所需样本量极少,并且由于微卫星序列较短,即使降解的DNA也可能包含足够用来扩增的微卫星序列。随着高效精确的基因分型自动化技术的发展,微卫星基因型检测将会更加快捷方便。目前,微卫星位点的检测一般采用以互补于两个侧翼序列的寡核苷酸(约20nt)作为引物通过 PCR扩增,然后再用测序凝胶分离检测其结果。1个位点的检测一般可在24h完成,且可同时进行多位点的检测。

(4)共显性标记:微卫星标记遵循孟德尔遗传法则,呈共显性遗传,因此能很好地区分纯合子与杂合子。

(5)中性标记:在多数情况下,微卫星标记没有任何表型效应,因而不存在对家畜个体的有害或次级效应。

2.微卫星的缺陷  由于在不同物种中微卫星侧翼序列有所不同。针对不同物种,尤其是一些珍稀物种,往往需要进行费时费力的特异性引物设计。目前针对微卫星的研究普遍是基于等位基因之间只存在重复单位数目差异的假设,通过使用与重复序列两端的侧翼序列配对的引物进行PCR扩增,再经电泳分离不同等位基因。但是,该方法没有真实反映出微卫星位点在DNA序列上的变异。一些研究显示微卫星位点在序列上也存在许多变异。例如Clisson等(2000)发现在不同灵长类物种之间,微卫星重复序列两端的侧翼序列可以发生插入或缺失,而且多为几个相邻碱基同时发生。而Garza等(1995)也发现微卫星的重复单位序列存在不足。这些结果反映出微卫星进化的复杂性,从而可能出现同源异型(微卫星重复序列相同,但PCR产物长度不同)或者是异源同型(微卫星重复序列不同,但PCR产物长度相同)。因此,单纯使用PCR产物片段进行研究可能得出错误结果。此外,PCR扩增受到许多因素的影响,使一些等位基因无法被扩增出来。比如发生在引物3'端配对碱基的突变可以严重影响PCR效率(Koorey, et al.1993)。这些没有被扩增的等位基因称为“无效基因”(null allele)。无效基因的存在会影响亲子鉴定的正确性。为了避免由此引起的错误,对那些已经知道存在无效基因的位点,最好只使用父母双方都是杂合、而且两个杂合等位基因都能被扩增的数据。

四、生物芯片与微卫星技术

微卫星技术尽管有许多优点,但比较费时尤其是微卫星位点未知的情况下,如果把生物芯片与微卫星技术结合起来,就变得简便快捷。

1.通过生物芯片加速微卫星位点的筛选  生物芯片的基本原理就是核酸杂交,微卫星位点的获得过程中,工作量最大的是克隆片段的筛选,应用生物芯片可以快速、一次大量地筛选多个片段。

2.利用芯片进行PCR扩增  应用微卫星技术研究动物的遗传多样性时,需要对数量较多的个体进行分析,而且需要多个微卫星位点,所以进行的PCR扩增反应也很多。PCR芯片是利用DNA芯片发展起来的,比常规的PCR扩增需要的时间少,效率高,所需的反应液体积少,因而有利于减少微卫星分析的时间,提高效率,也更加有利于“非损伤性DNA技术”在微卫星分析中的应用。

3.利用毛细管电泳型生物芯片分析PCR扩增结果  毛细管电泳分析法是建立在聚丙烯酰胺凝胶电泳的基础上的,由于毛细管直径小,热量和电泳速度均匀,且不需载体等,因而比聚丙烯酰胺凝胶电泳的效果更好。所以微卫星位点的多态性可以利用毛细管电泳型生物芯片分析。

4.将微卫星位点制成芯片进行多态性检测  对于微卫星位点数知道得较多的物种,将其微卫星位点制成芯片然后将需检测个体的DNA与芯片进行杂交检测,即可得到所需要的数据,这样大大减少了工作量。

五、微卫星标记在实验动物研究中的应用

1.遗传图谱构建  微卫星因其上述特点和优点而成为目前构建完整遗传连锁图谱时的首选标记。利用微卫星DNA标记,可以进行遗传连锁分析,构建遗传图谱。在陆地许多生物中,包括人、大鼠、牛、羊等动物的基于微卫星DNA的连锁图谱已逐渐发展起来。基本思路是,以微卫星为基础,在基因组中每隔一定距离找一个多态微卫星标记,当这些标记达到一定饱和度时(平均间隔不大于20cM并覆盖90%以上基因组),便可据此绘制出一个基本的遗传图谱。主要家畜如牛、绵羊、猪等的连锁图谱已建成,并且饱和度日趋增大。图谱上的标记以微卫星为主,也有少量的RFLP、RAPD标记。

牛的第一张微卫星标记遗传连锁图谱由Barendse于1994年建成,至今又有几个不同版本的牛遗传连锁图谱绘制出。在猪遗传连锁图谱上微卫星标记共计1042个,总长度2286.2cM,标记间平均距离为2.23cM。1998年De Gortari等发表了绵羊的第二代遗传连锁图谱,其上共有标记519个,其中504个为微卫星,常染色体图谱总长度为3063cM,标记间距为6.4cM。这种高密度遗传连锁图谱的建成为基因定位、物理图谱的构建及基因的位置克隆(positional cloning)奠定了基础。

2.数量性状位点(QTL)定位  QTL定位就是以一定饱和度的遗传连锁图谱为基础,通过连锁分析,确定家畜QTL在图谱上的位置、与特定标记间的遗传距离。QTL定位已成为目前家畜遗传育种研究领域的一个热点课题,其中基因组扫描(genome scanning)是QTL定位的主要方法之一,即以已构建的遗传连锁图谱为基础,利用连锁分析的原理分析基因组中大量散在分布的多态性标记(多数为微卫星标记)与数量性状变异的连锁关系,进而借助这些标记跟踪对数量性状表型有影响的功能基因在染色体上的位置及其效应,从而找到QTL。Andersson等率先在一个由欧洲野公猪与大白猪建立的资源家系中发现猪4号染色体微卫星S0001~S0107区域存在脂肪沉积和背膘厚的QTL。

3.标记辅助选择  借助微卫星进行标记辅助选择(marker assisted selection, MAS)具有广阔的应用前景。MAS的一个应用是有利基因的转移。在传统的回交育种过程中,随着有利基因的引入,与有利基因连锁的不利基因(或染色体片段)也会随之导入,成为连锁累赘。然而利用与目的基因紧密连锁的微卫星标记,就可以直接选择在目的基因附近发生重组的个体,从而避免或显著减少连锁累赘,提高选择效率。MAS的另一应用是基因的累加。家畜有许多基因的表型是相同的,在这种情况下,经典的遗传育种研究就无法区别不同的基因,因而无法鉴定一个性状是受单个基因还是多个具有相同表型的基因共同控制。借助微卫星标记,先在不同亲本中将基因定位,然后通过杂交或回交将不同的基因转移至一个品种,通过检测与不同基因连锁的微卫星标记的基因型来判断个体是否含有某个或几个基因,以帮助选择。

4.遗传多样性评估  家畜遗传多样性一般指品种内个体在DNA水平上的差异。通过对遗传多样性的评估,可了解家畜品种的遗传结构、生活背景,分析其进化的历史和潜力,以及探讨品种濒危的原因和现状,提出合理的保种措施。为此,利用微卫星标记,检测个体基因型,统计群体中的微卫星位点等位基因的数目和频率,结合分子遗传学和数量分类学原理,计算各个品种的遗传变异程度、生存稳定性,初步评估品种的遗传多样性及品种间的关系亲缘与分化关系。Kacirek等利用18个微卫星分析了大白、约克夏及汉普夏3个猪种间的遗传变异。杨澜(1999)利用5对牛微卫星引物和10对绵羊微卫星引物分析了5个中国地方山羊品种的遗传多样性。

生物多样性问题现在已成为人们关注的焦点之一。生物多样性可以定义为所有活的生物体中的变异性,包括陆地、海洋和其他水生生态系统及其所构成的生态综合体;它包括物种内多样性、物种间多样性、生态系统的多样性3个层次。生物多样性的保护和可持续利用是维持全球经济稳定和发展的重要因素,也是保持我们赖以生存环境的重要内容。精确地评价生物多样性水平,能为生态资源的保护提供理论依据。如前所述,从形态、细胞、生化、分子等不同层次上可以揭示物种的变异性。近年来各种分子标记的发展和应用,以及比较基因组学的兴起为这一工作的深入开展提供了有力的工具。其中,微卫星DNA标记技术已成为检测物种遗传多样性的一个重要手段。目前,在国外这一技术已应用于牛、羊、马,小麦、水稻等重要的评估和管理。严格来说,对物种多样性水平的检测同物种遗传结构分析是紧密相连的,对物种多样性水平的评估可以说是遗传结构研究的继续深入。只有掌握了物种的多样性水平和群体的遗传结构,才能制定有效的保护策略和措施。微卫星作为理想的遗传标记,在研究动物遗传多样性和建立遗传谱系中,已经得到了广泛的应用,推动了保护遗传学的发展。

5.种群遗传结构分析  种群遗传结构的研究,从形态和生理生化的孟德尔性状的描述,到分子生物学手段定性定量研究,出现了许多以物种DNA多态性为基础方法,如RFLP、RAPD、AFLP等。微卫星方法与其他分子生物学手段相比,在不同实验条件下具有很好的稳定性,且提供的多态性信息也十分丰富,是一种较为理想的分子标记。而且,在个体水平上的遗传结构的分析,微卫星标记要优于其他一些方法。但是,对物种进行遗传分析,仅仅依靠一两种手段是不够的,根据不同的研究目的将微卫星DNA标记与其他方法结合起来,才能更有效地对遗传结构作出分析。

利用微卫星DNA的孟德尔遗传特性及共显性的特征,我们可以通过分析基因型特征来确定种群的遗传杂合度,同时可以进一步描述种群的遗传结构。Gr.wolhs等用微卫星标记应用于对虾的养殖选育计划,对高健康虾品系中的6个地理种群共16个家系312只对虾进行了微卫星DNA的分析,阐明了每一家系的亲代与其后代之间的遗传关系,共获得了47个不同的等位基因位点,并且还比较了种群的预期及观察遗传纯合度,确定了23个种群特异性标记探针。

6.系谱确证  在家畜育种中必须搞清畜群的亲子关系,这样才利于根据亲属信息准确选留个体并防止群体近交的发生。然而在某些情况下(如寄养、母畜返情重配等),却不能准确判断某一个体的亲代。如今借助多个微卫星标记位点在群体中的等位基因频率,通过计算排除率(exclusion probability)便可进行亲子鉴定和血缘控制。Ellegren等研究表明,组合使用5个微卫星位点(每个位点有6个以上的等位基因)时排除率为98%,而使用10个这样的微卫星时排除率可高达99.99%。 Van Zereren等利用7对微卫星引物对4个比利时猪种进行亲缘关系鉴定,排除率均超过95%。可见使用这种方法对家畜进行系谱确证是非常适合的,因为基因型结构的基本元素对于亲代和子代是完全相同的。

7.遗传监测  实验动物质量对医学生物学研究中动物实验结果的准确性、重复性及科学性有重要影响。随着生物医学科学的发展,对实验动物和实验材料的标准化要求越来越高。实验动物遗传监测是评定和保证实验动物质量必不可少的措施。在传统的遗传监测方法中,形态学标记是利用外部形态,即利用表现型来进行检测,但表现型易受外界环境因素的影响;细胞学标记大多数情况下都要求对细胞进行培育,并进一步制备染色体,而且此类标记数目相对较少。免疫学标记仅能测定一个近交系是否具备同源性,无法确定基因的纯合性;生化标记信息含量低,根据某些生物化学标记,诸如同工酶所进行的遗传检测分析只能检测编码区的基因座位,且该方法受现在酶电泳和染色方法所限。新兴的分子生物学标记中, RAPD实验结果稳定性差,RFLP和southern杂交等方法都需要大量的、纯度较高的 DNA;微卫星DNA多态性标记是选择该位点两侧的侧翼序列为引物,进行锚定 PCR扩增,重复性高,可比性强。因此,微卫星DNA多态性标记在遗传监测方面是较理想的方法。多态性标记在实践中一方面监测是否发生遗传污染,另一方面可以同时确定样本的品系。

李军林等(2001)采用10对微卫星引物对BALB/C-nu-nu、DBA/2、SCID、T739、TAt、615 6种近交系小鼠进行遗传监测,试图寻找相关品系遗传监测的基因位点和应用于实际监测。除1个位点表现为单态性外,其余9个微卫星位点表现出多态性。其中D2Mit3、D3Mit15、D3Mit17、D3Mit18等4个位点多态性显著,这4个位点适宜用于小鼠遗传监测。上述结果说明微卫星DNA多态性标记适用于近交系小鼠遗传监测,有助于遗传监测从表现型过渡到DNA水平。

刘宇飞等采用49对微卫星引物对RR-B系剑尾鱼和红眼红体的非选育系剑尾鱼进行PCR扩增,有46个微卫星座位能获得稳定的扩增产物,7个微卫星座位能区分RR-B系与非选育群体剑尾鱼。7个微卫星座位在选育系剑尾鱼为单态纯合,而在非选育群体具有多态性,座位Msa014鉴定RR-B系剑尾鱼排除概率最高,为98.75%,座位Msd003排除概率最低达到了87.50%,其余5个座位排除概率介于两者之间。为方便今后的遗传监测,对RR-B系剑尾鱼样品的7个微卫星座位进行了测序,确定了其大小和具体的微卫星结构。本实验建立了RR-B系剑尾鱼分子检测方法,为实验动物剑尾鱼的遗传监测奠定了基础。

商海涛等应用小鼠和大鼠的微卫星标记筛选适合于金黄地鼠遗传检测的微卫星标记,并结合微卫星荧光标记.半自动基因分型技术,对成都生物制品研究所的 SPF级金黄地鼠及其来源的普通级金黄地鼠进行遗传检测,计算其群体遗传学参数。对18个小鼠和6个大鼠微卫星标记进行了筛选,分别有2个小鼠和2个大鼠微卫星标记在金黄地鼠种群中具多态性。4个检测的微卫星位点在普通级金黄地鼠和SPF金黄地鼠种群分别发现25和20个等位基因,两群体的期望杂合度分别为0.4979和0.5048,其群体遗传多样性无显著差异;群体间的不同微卫星位点 FST范围为0.0095~0.0367,平均为0.0315,表明两群体间的遗传分化很弱,其遗传多样性主要存在于群体内;Nei(1972)遗传距离和Nei(1978)无偏遗传距离分别为0.0678和00570,表明了两群体之间很高的遗传相似度和非常近的亲缘关系; Hardy-Weinberg平衡检验表明普通级和SPF金黄地鼠分别有2和3个位点偏离遗传平衡,且偏离位点均表现为杂合子缺陷。该SPF金黄地鼠基本保持了其来源普通级黄地鼠的遗传多样性,两群体间遗传分化程度和遗传差异很小,但应进一步加强其封闭群的繁育控制,保持其遗传稳定性。

应用分布于13条染色体上的35个微卫星基因座对3种小型猪进行了遗传学检测,结果如下。品系(家系)近交程度分析,根据本试验微卫星座位的基因分型结果,计算三品系小型猪在35个位点的平均基因纯合率:贵州小型香猪为74.05%、广西巴马小型猪为67.36%、版纳小耳猪近交系为84.22%。表明三品系小型猪的近交程度均较高。根据t检验结果,贵州小型香猪的近交程度比广西巴马小型猪高,版纳小耳猪近交系的近交程度最高。版纳小耳猪近交系14世代平均基因纯合率最高的为JS亚系的151家系,达到88.79%,最低的133家系也达到79.14%。可以看出,随着近交世代的增加其平均纯合率呈现递增的趋势。这说明版纳小耳猪近交系经过长期近交已达到了很高的近交程度,并且随着进一步近交其平均基因纯合率亦逐步增加。品系(家系)内的遗传变异:由个体基因型计算出3个品系小型猪35个微卫星基因座各等位基因的基因频率,据此计算全部基因座平均多态性信息含量(PIE)、平均杂合度及基因分化系数。除了sw973在所有样本均表现为单态性纯合,其他34个微卫星位点在3个品系小型猪中呈不同程度多态性。三品系小型猪的平均PIC和平均杂合度和其他商品猪种相比明显较低(P<0.5)。表明伴随近交选育,3种小型猪的遗传背景变窄,基因多样性下降。伴随近交过程基因发生严重分离,纯合有害基因的个体因适应性差而不能生存或繁殖,只有纯合有利基因的个体才能够稳定生存和繁殖,从而导致了基因多样性的低水平。

徐其放等通过微卫星分子标记技术对美国进口、广州自养beagle犬基因组中存在的微卫星结构进行分析,研究其群体的微卫星多态性,以此探索在分子水平上对作为实验动物的beagle犬进行检测。在研究位点上共发现6个复等位基因,进口犬群体共有6个等位基因片段,自养犬群体共有5个等位基因片段,根据基因型计算各群体等位基因频率,由相关公式计算杂合度、群体多态信息含量(PIC)、基因纯合率、基因分化系数。两群体的杂合度、PIC值均较高(分别为0.7010、0.6747和0.7876、0.7515),基因分化系数很低(0.021),表明两群体没有形成明显的独立群。

随着不同实验动物染色体高密度微卫星标记图谱的构建,以及实验技术的改进,统计方法的完善,微卫星标记将会在实验动物学研究领域获得更广泛的应用。


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