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实验方法

山医群体中国地鼠微卫星遗传检测体系的建立

2020年09月16日 浏览量: 评论(0) 来源:《遗传标记在实验动物遗传质量控制中的应用》 作者:宋国华 责任编辑:yjcadmin

一、材料与方法

1.实验动物  山西医科大学实验动物中心培育的中国地鼠近交A家系群体,随机取24只地鼠作为研究对象,取尾巴组织作为实验材料。

2.基因组DNA的提取  用常规酚三氯甲烷方法提取中国地鼠基因组DNA,提取方法同前。

3.微卫星PCR反应  微卫星引物序列和退火温度见表5-10。

PCR反应总体积为10μl,其中模板DNA 1.0μl、上下游引物各1.0μl、10×buffer 0.8μl、dNTP0.7μl、rTaq酶0.08μl、ddH2O 5.42μl。PCR扩增程序为94℃5min,94℃30s,退火45s(根据不同引物采用不同的退火温度,具体温度见表5-10),72℃ 45s,共35个循环,最后72℃ 20min。在每次PCR扩增时,均设一个阴性对照,以ddH2O为模板,其他条件均相同,以确定每次PCR过程中均不存在由于外源性DNA污染所产生的不真实的电泳条带。

取2μl的PCR扩增产物加2μl上样缓冲液混匀后,在2%的琼脂糖凝胶上进行电泳分离,电泳缓冲液为1×TBE,电压180V,电泳时间约为15min。

4.毛细管电泳  取水平电泳有条带的PCR产物进行纯化,进行STR扫描,即毛细管电泳。

纯化的步骤如下:

(1)根据水平电泳的结果,移取3~5μl PCR反应产物至一新的384孔板中。

(2)每孔加入95%的乙醇醋酸铵混合液(30:1),乙醇醋酸铵混合物与PCR产物的比例约为3:1,使乙醇的终浓度为70%,混匀放在-20℃冰箱中冷却20min。

(3)4300r/min,4℃,离心30min;弃上清,倒扣在吸水纸上放入离心机倒甩至500r/min。

(4)每孔加入33μl 70%的乙醇,混匀,4300r/min,4℃离心15min,倒扣在吸水纸上放入离心机倒甩至500r/min。

(5)避光晾干,约20min。加入有内标GeneScanTM-500 LIZTM (Applied Biosystems, Inc.)的loading buffer(去离子甲酰铵)8μl,上机荧光扫描。

5.数据处理  荧光扫描结果用GeneMarker V1.6(Applied Biosystems, Inc.)进行基因型判读,用microchecker、MStools检查数据的准确性,用popgene计算A家系个体间遗传相似性。

二、结果

1.中国地鼠微卫星遗传检测体系的建立

(1)PCR扩增体系的建立:PCR反应总体积为10μl、其中模板DNA 1.0μl、上下游引物各1.0μl、10×buffer 0.8μl、dNTP 0.7μl、rTaq酶0.08μl、ddH2O 5.42μl。PCR扩增程序为94℃ 5min,94℃ 30s,退火45s(根据不同引物采用不同的退火温度,具体温度见表5-10),72℃ 45s,共35个循环,最后72℃20min。

(2)毛细管电泳荧光标记检测体系的建立

①PCR产物稀释倍数:本实验对PCR产物最终稀释倍数设定梯度50×、100×、150×、200×、250×、300×。结果表明PCR产物稀释到300×仍能正常被检测。鉴于实验操作方便,本实验采用稀释200×为PCR最终稀释浓度。

②分子量内标的加入量:ABI公司规定,每100个反应加入50μl分子量内标进行电泳检测。由于ABI3730DNA分析仪所配套的试剂昂贵,为了降低实验成本,本实验调整了分子内标的量。结果表明,加入4~5μl分子量内标能使每根毛细管中的电泳结果得到有效分析。

2.中国地鼠A家系的遗传相似性分析  用popgene软件计算A家系24个样本间的Nei氏遗传相似性,详见表5-11。平均遗传相似性为0.9195,遗传距离为0.0805。

三、讨论

1.微卫星标记在近交系实验动物遗传监测中的应用  近交系是指经连续20代以上的全同胞兄妹或父女、母子交配培育而成,品系内所有个体都可以追溯到起源于第20代或以后代数的一对共同祖先,这种交配方式的最终结果是同一品系内的动物基因高度纯合,其基因纯合度达到98%以上,亦即子代与母代的基因型基本一致,品系内个体差异趋于零。虽近交系动物高度近交,但近交系动物在培育、保种、繁殖生产等过程中仍存在遗传污染或遗传突变的可能性,所以,为保证近交系实验动物的遗传质量,寻求理想的遗传监测方法非常必要。

近交系动物遗传质量的检测方法有形态学检测法、染色体带型检测法、生化标记检测法、免疫学技术检测法、分子生物学标记检测法。前4种是传统的监测手段,是间接的遗传检测方法,它们主要是利用表型特征的变化来推测相应的基因变化为原理。上述表型特征作为遗传标记,不同程度上存在精确度不高,易受外界环境因素影响,缺乏遗传稳定性,并且大多数标记无法覆盖近交系动物的全部染色体和基因位点等缺点,且其中有些方法(如染色体分带技术和免疫遗传学标记)操作较复杂,对近交系动物遗传监测带来诸多不便。分子生物学标记技术是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段。与表型标记相比,DNA分子标记技术具有能对各发育时期的个体、各个组织、器官甚至细胞作检测,既不受环境的影响,也不受基因表达与否的限制;数量丰富;遗传稳定,对生物体的影响表现“中性”以及操作简便等特点。它能同时检测基因组上多个位点,有丰富的多态性,比传统的标记更准确、更可靠。

利用微卫星DNA侧翼序列设计引物进行PCR扩增,由于重复次数不同形成的扩增产物的片段长度亦不同,经STR扫描后,就可表现不同的基因型,从而判断是否发生遗传污染或遗传变异。用一定数量的引物对微卫星进行扩增,如均表现相同的基因型,则表明基因位点纯合,符合近交系要求;反之,则可能发生了遗传污染或遗传变异。不同品系及同品系不同个体地鼠的扩增产物,如果STR扫描后只有一种基因型,表明没有发生遗传污染或遗传变异。如果呈现两种或两种以上的基因型,则表明该位点是杂合的,已发生遗传污染或遗传变异。因此,应用微卫星标记方法不但可以进行纯合位点的判定,而且能对基因位点的变异情况进行分析,适于近交系动物的遗传检测。

2.遗传相似性分析  中国地鼠A家系运用微卫星技术检测的遗传相似性为0.9195,遗传距离为0.0805,进一步说明山医群体中国地鼠的遗传多样性减少,遗传性状得到了纯化。与用RAPD分析遗传纯度得到的结果相比,中国地鼠A家系遗传相似度较低。产生这一现象的原因可能是本研究所采用的微卫星引物较少,中国地鼠A家系进行分析的位点数只有25个,而RAPD因为引物较多,分析的位点数为266个,而且微卫星检测得到的片段的特异性要较RAPD检测到的高,故导致微卫星检测得到的遗传相似度低于RAPD检测结果。周莉在应用RAPD和微卫星标记对雌核发育银鲫的遗传多样性进行研究时也发现了这种现象。对于种内个体间遗传距离测定,因实际遗传距离不大,要较精确地确定其遗传距离,就要在所选用位点的数目和多态性上多加考虑,增加所考察的微卫星位点数目,将会使所估计的结果更准确。


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