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脑缺血动物模型的研究进展

2020年09月18日 浏览量: 评论(0) 来源:中国实验动物信息网 作者:李晓菲译 责任编辑:admin
摘要:本文首次对脑卒中患者的左、右半球缺血与临床前研究进行了比较,探讨了脑缺血和脑缺血再灌注在不同阶段的作用机制。

摘要:脑卒中具有发病率高、致残率高、复发率高、死亡率高等特点,严重威胁着人类的健康,给受灾家庭和社会带来了沉重的经济和精神负担。许多临床前有效的药物以临床转化失败告终。动物模型是研究疾病和药物效应的重要手段,在生物医学研究中占有重要地位。关于脑缺血的动物模型的一些细节尚未公布,例如左侧/右侧病变或永久性脑缺血/脑缺血再灌注。本文首次对脑卒中患者的左、右半球缺血与临床前研究进行了比较,探讨了脑缺血和脑缺血再灌注在不同阶段的作用机制。结果显示,左半球卒中在临床患者中更为常见,大多数卒中患者均无法成功实现再通。永久性脑缺血模型与脑缺血再灌注模型在早期、亚急性和恢复期均有显著性差异 。因此,建议除已确定的实验目的或药物作用机制外,应优先考虑左侧永久性脑缺血动物模型,因为它们更符合临床情况,并能促进临床转化。此外,还提供了有关这些动物的术前处理、手术操作和术后护理的其他细节,以帮助建立一个精确、有效、可重复的脑缺血模型,为该领域的研究人员提供参考。


关键词:脑缺血模型  左、右半球缺血   永久性脑缺血   脑缺血再灌注  临床转化


脑缺血动物模型中的左右不对称:成人大脑存在不对称性,一个半球占优势。这里用手来识别优势半球。百分之九十(90%)的人是右撇子。大多数右撇子的语言中心位于左半球,被认为是占主导地位的半球。与非优势半球相比,优势半球具有更复杂的功能。 此外,据报道优势半球和非优势半球局部缺血的病理表现有所不同。研究表明,大脑不对称不是人类的独特特征,并且在脊椎动物中很普遍。优势半球缺血导致大鼠更严重的神经功能障碍,而非优势半球缺血的动物神经行为功能恢复得更快。其他研究报告了早期MCAO模型左右两半球的梗死体积有显著差异。左半球缺血导致更严重的感觉运动障碍,而右半球缺血则产生更严重的认知障碍。同样,左侧和右侧缺血之间的生化水平也存在差异。 一项研究发现左侧和右侧脑缺血后纹状体中编码生长因子的基因表达差异。大脑皮层和蓝点细胞核中去甲肾上腺素和多巴胺的变化也不一致,并且右杏仁核中强啡肽的浓度在缺血后3-5天达到峰值。这些结果表明,大鼠大脑半球存在左右不对称性,缺血后左右半球的行为和生化变化也不同。因此,在脑缺血实验中,不应忽视大脑的不对称性。

图1、左右侧脑缺血发表论文数比较

左半球脑缺血发生率高于右半球:动脉结构与血流:其他研究人员从动脉结构的角度解释了这一差异,因为颈动脉内膜-中膜厚度(IMT)与中风之间存在显著相关性,尤其是非腔隙性中风(动脉粥样硬化性中风和心源性中风),其发病率在左半球高于右半球。结果表明,这与左、右动脉IMT的差异有显著关系,这种差异主要是由于左、右动脉的解剖结构不同所致。如图2所示,大脑中动脉起源于颈总动脉(CCA)。左CCA直接起源于主动脉弓,与升主动脉平行,而右CCA起源于右臂主干,造成左、右CCA血流动力学差异。在这种情况下,左CCA的流动速度更快,其剪切力高于右CCA,从而导致左CCA的IMT自适应增厚。认为高剪切力或振荡剪切力是IMT自适应加厚的有力决定因素。尽管在高剪切应力下的IMT本身不会引起动脉粥样硬化,但是在壁剪切方向上发生明显的振荡可能会促进在远处发生动脉粥样硬化。 另外,主动脉弓的血流也可能引起左溃疡斑块,这可能导致脑栓塞性中风。

图2、左右脑动脉解剖结构的比较

高血压患者的血流动力学差异更为明显。据报道,未经治疗的高血压患者左CCA的IMT大于右CCA的IMT。而且在60岁以下的患者中,这种差异随着年龄的增加而增加,60岁以后逐渐减小。因此,在动物模型的建立过程中,左侧缺血与右侧缺血的选择不容忽视。临床左、右半球缺血性卒中患者分布不均,提示临床前研究可优先选择左半球缺血性脑卒中动物模型,以促进临床结果的转化。然而,这并不意味着不建议对右侧缺血模型进行研究。对右侧脑缺血患者的诊断不足提醒了研究者应加强对右侧脑缺血模型的重视。观察到的左右半球脑缺血的生化和行为差异表明,可以根据实验目的选择缺血侧(左:运动功能障碍;右:记忆障碍)。然而,关于左右侧脑缺血的差异性研究却很少。

永久性脑缺血与脑缺血再灌注模型的比较:

临床前研究主要使用脑缺血再灌注模型:永久性脑缺血模型可模拟无血管再通的患者,而脑缺血再灌注模型可模拟具有血管闭塞并及时再通的患者。 两种模型的病理机制明显不同。究竟是制作永久性脑缺血模型还是缺血再灌注模型,仍然是个问题。MCAO模型在缺血性脑卒中的研究中被广泛应用,因此,暂时性MCAO(tMCAO)和永久性MCAO(pMCAO)也被用于研究。使用以下搜索词搜索了CNKI:“永久性脑缺血”或“脑缺血-再灌注”,“ tMCAO”或“ pMCAO”,结果显示,从1952年到2020年, 关于脑缺血-再灌注的出版物的数量远高于关于永久性脑缺血的研究。由于CNKI数据库的局限性,对PubMed数据库进行了检索,得到了相似的结果。

图3、关于永久性脑缺血和脑缺血再灌注或tMCAO和pMCAO的出版物数量和学术重点的比较

脑缺血后及时血管再通是最直接,最有效的治疗方法。 但是,再灌注会引起新的损害。 因此,许多研究已使用脑缺血再灌注模型开发神经保护剂。而且,与永久性缺血相比,血流再灌注可以使药物到达梗塞区域并充分发挥其作用。这可能是大多数研究人员使用脑缺血再灌注模型的原因之一。此外,在大多数研究中,再灌注是在闭塞后90-120分钟进行的,原因如下:1) 闭塞后再灌注0.5-1h的大鼠梗死轻微,变异性大,无认知功能障碍。另外,这些大鼠术后神经行为能很快恢复,不符合长期测试的要求。2) 当血管阻塞3或4小时时,再灌注可导致梗死体积增加,这与永久性缺血相称;然而,死亡率增加。 3)通过腔内缝合达到并持续≥2h的MCAO引起自发性高热,与大鼠下丘脑损伤有关; 这在人类临床卒中中未观察到。临床结果表明,如果在症状发作后的前90分钟内开始溶栓治疗,则会观察到最佳结果。血管闭塞90–120分钟后进行的再灌注可诱发稳定的神经系统疾病和再灌注损伤,成功率更高,死亡率更低且存活时间更长,可以满足实验要求。值得注意的是,与大鼠相比,小鼠更容易受到闭塞时间的影响。

永久性脑缺血与脑缺血再灌注的区别:永久性脑缺血与脑缺血再灌注的病理机制有明显区别。永久性脑缺血主要是一种缺氧缺血性的原发性损伤,血流量的微小减少不会导致明显的功能或代谢紊乱。随着缺血时间的延长,缺血核心逐渐扩展到缺血半影区,梗死体积达到最大。如果及时恢复血流,则可以逆转梗塞性核心损伤。 否则,介入治疗只能抑制梗塞核心的扩张。 此外,如果再灌注被延迟(≥3小时),其逆转作用将非常弱,并导致更严重的缺血再灌注损伤。 脑缺血再灌注主要导致继发性(非缺血性)细胞死亡。再灌注改变缺血后的生理和病理过程,导致脑卒中急性期(24h)、亚急性期(3d)、慢性恢复期(7d)有明显差异。基因谱分析还表明,脑缺血再灌注损伤与炎症和凋亡途径有关,而永久性脑缺血损伤则与神经递质受体、离子通道、生长因子等途径有关。另外,药物对两种模型的作用不同。

图4、永久性脑缺血模型与脑缺血再灌注模型的时空机制差异。

目前,这两种模式在机制上的差异值得进一步澄清。准确描述两种模型损伤发展的时空变化,有助于实现两种模型从缺血急性期到恢复期的精确治疗。此外,模型的临床前选择取决于所研究药物的种类及其感知的作用机理,这也为该选择提供了参考。 例如,应优先使用脑缺血再灌注模型测试自由基清除和抗炎药,而谷氨酸拮抗剂测试应优先选择永久性脑缺血模型。但是,在临床前研究中,研究人员将注意力集中在脑缺血再灌注模型上,其机制的逐渐丰富为该模型的选择提供了更多参考。 相反,关于永久性脑缺血的研究很少。

永久性脑缺血患者的临床优势:目前,临床前研究大多采用脑缺血-再灌注模型,然而,大多数缺血性中风患者并没有成功地再通。rt-PA是目前美国FDA批准用于治疗中风的唯一溶药,但其时间窗窄、出血风险大,限制了其临床应用。近年来,rt-PA的使用率不断提高,从2006年的9.9%上升到2018年的21.8%。然而,再通率仍需提高,rt-PA溶栓失败的患者中只有一小部分可以成功进行机械血栓切除术。 总体而言,永久性脑缺血未再通的患者仍然占大多数。研究热点与临床需求之间的矛盾可能部分解释了临床药物转化的失败。 建议除确定的实验目的或药物机制外,在临床前研究中应优先考虑永久性脑缺血的动物模型。

图5、脑缺血动物模型与临床脑卒中亚型的差异。

但是,考虑到人脑卒中的异质性,药物应考虑在多种不同模型和物种中的临床前疗效,并考虑转化为临床试验之前改善短期和长期的组织学和功能参数。总之,主张永久性脑缺血模型不容忽视。精确的模型反映了大多数临床脑卒中病例,有助于临床转化。此外,临床转化时,不应混淆两种模型对应的病理机制。然而,这并不意味着不应采用脑缺血再灌注模型。随着医疗技术的进步,将有更多的病人能够快速成功地再通。溶栓方法与神经保护剂的联合应用也将逐渐成熟。


动物手术:可以得到关于动物品系,性别,年龄和缺血性中风危险因素模型的许多报告。流行病学调查显示,中风的发生率很大程度上取决于年龄。 人的中风多发于中老年人。因此,建议以中老期动物为研究对象,而不是老期的动物作为研究对象。女性中风的发病率并不低于男性,而且取决于年龄。此外,临床中风患者往往表现出中风的危险因素(高血压、高血糖和动脉粥样硬化)。不幸的是,大多数临床前研究都使用年轻健康的雄性动物作为研究对象,这可能部分解释了药物临床转化的失败。老年动物的神经免疫微环境转为促炎状态。此外,老年动物脑组织抗氧化能力下降,脑缺血再灌注早期表现出强烈的炎症反应,并伴有小胶质细胞和巨噬细胞的活化增强;此外,它更容易凋亡,从而导致更大的梗死面积和更严重的神经功能缺陷。此外,老龄动物大脑环境的变化可能不利于新细胞的存活或神经元的生长。 这些因素抑制了老年大鼠神经功能的恢复。据报道,药物对老年动物的神经保护作用减弱。其他研究表明,长期暴露在低温下可以通过改善新陈代谢来减少老年动物的大规模损伤。粒细胞集落刺激因子(G-CSF)能促进神经发生,有利于老年大鼠脑卒中后神经功能的恢复。与骨髓间充质干细胞联合应用可增加血管生成,但不能进一步改善卒中后恢复。许多疾病的发病率,如糖尿病、高血压和高脂血症,随着年龄的增长而增加,这也增加了中风的风险,增加了死亡率和致残率。其中,高血压是最重要的可变危险因素。血管紧张素转换酶抑制剂也能减少中风后吸入性肺炎。临床前研究已经证明,高血压可以降低血脑屏障的完整性,增加白质损伤和水肿,并加重脑缺血损伤。因此,自发性高血压大鼠(SHRs)表现出更大的梗塞。 据报道,NMDA受体拮抗剂地佐环平(MK-801)和常压高氧(NBO)可以显着减轻血压正常大鼠的梗塞,但不能减少SHR的梗塞面积。流行病学研究表明,50%以上的脑卒中患者有高血糖,且伴有糖尿病的中风患者趋于年轻化。高血糖症可通过加重血管内皮功能障碍并促进早期动脉硬化,全身性炎症和毛细血管基底膜增厚或增加乳酸产生来诱发中风。这会导致更严重的代谢紊乱和钙稳态,氧化应激和炎症,从而加剧缺血性损伤,尤其是皮质梗死,并导致预后不良。据报道,降糖药,如吡格列酮,也可以降低糖尿病患者卒中复发率。研究表明,在中风小鼠模型中,高血糖会导致更严重的梗死和水肿,加重感觉运动和认知障碍,并阻碍神经功能的恢复。有趣的是,用胰岛素治疗的糖尿病大鼠的梗死面积与正常大鼠相似。肥胖和动脉粥样硬化是脑卒中的重要危险因素。上述研究结果表明,中风的发病机制和预后与年龄和共病有关。在这些动物模型中,药物可能不能激活年轻雄性动物的相关通路并发挥神经保护作用。

封堵器:封堵器尖端的物理特性(尖端直径、尖端长度、尖端形状和灵活性)在脑梗死变异和蛛网膜下腔出血(SAH)的发生中起着至关重要的作用。理论上,将封堵器的大小与动物的大小相匹配可以提高模型的一致性。对于不同的啮齿类动物体重,建议使用市售封堵器,可以提高手术成功率,增加实验的一致性,降低SAH发生率。另外,这也增加了不同实验室的结果的可比性,这更有利于系统评价,并为临床转化提供了更科学准确的数据。

禁食:在这一领域的许多研究报告中,动物在手术前禁食12-24小时。但事实上,啮齿类动物缺乏呕吐反射,代谢率较高。空腹6小时可能会导致体重减轻和肝糖原耗竭; 因此,禁食过夜可能会影响动物的生理状态和手术耐受性,以及候选药物的神经保护作用。因此,不建议术前禁食,除非需要进行食欲行为测试、血糖测试或其他实验。

手术期间:许多常用麻醉剂已被证明具有神经保护作用。因此,需要考虑麻醉剂的作用机制,避免与候选药物发生相互作用。麻醉过程中应监测生理参数,尽可能缩短麻醉时间,以减少麻醉对动物的影响。MCAO可通过CCA或颈外动脉(ECA)切口进行,将封堵器引入颈内动脉(ICA)。对于pMCAO,CCA入路可能是一种较简单的外科手术,而ECA入路是暂时性MCAO的较好选择,因为它可以保持再灌注所需的解剖完整性。假手术组有助于排除程序本身对中风动物模型的影响。在一些文章中,假手术组的操作只包括将CCA与ECA分离。然而,封堵器插入引起的机械刺激可导致内皮细胞功能障碍和血管舒缩功能障碍。在一些研究中,在假手术组中,仅将封堵器插入CCA中,而未到达ICA,这不会引起大鼠的缺血和神经功能障碍。这种假手术最大限度地排除了手术和封堵器植入对大鼠的影响。

缺血评估:在临床前研究中,神经功能评分和梗死体积是评价候选药物疗效的首选指标。然而,需要注意的是,梗死体积没有变化并不证明候选药物没有神经保护作用。例如,碱性成纤维细胞生长因子可以在缺血恢复期间提供神经保护,但对梗死体积没有影响。此外,神经功能评估通常仅在临床前研究的急性或亚急性阶段进行,而临床评估时间通常延长至3个月或更长时间。 延长临床前神经功能的评估可能更有利于药物疗效的观察和临床转化。

术后护理:1) 脑卒中后群居:根据动物生活习惯,脑卒中后动物应与卒中前动物同组饲养,每笼应容纳假手术和中风动物,可降低卒中后死亡率。2)抗生素:外科手术的无菌性至关重要,抗生素可能会干扰肠道菌群并影响实验结果。 因此,如果提供外科手术的无菌环境,则不需要施用抗生素。3)镇痛:从伦理上讲,手术后应对所有动物进行镇痛,因为疼痛可能会影响动物的生理状态和候选药物的神经保护作用; 但是,必须避免止痛药的神经保护作用以及与候选药物的可能反应。4) 动物监测:手术会导致动物体液流失和进食障碍。因此,应监测动物的生命体征,及时补充体液和软性食物,特别是对有中风危险因素的模型动物。

图6、大鼠脑缺血脑组织梗死体积的整体和切片图。

结论:首次对临床脑卒中患者的左、右半球缺血与临床前研究进行了比较。本文首次综述了永久性脑缺血模型与缺血再灌注模型在疾病不同阶段的机制差异。根据临床卒中患者的类型分布,建议优先考虑左侧脑缺血模型, 或者根据实验目的选择模型(左:运动功能障碍;右:记忆障碍)。此外,除非确定实验目的和候选药物的作用机制,否则应优先考虑永久性脑缺血模型。本文提供了动物的术前处理,手术程序和术后护理相关细节,以建立精确,有效和可再现的脑缺血模型,并为该领域的研究人员提供参考。


原文出自:https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0753332220308799#fig0035

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