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实验方法

SNP标记技术用于遗传检测的应用实例

2020年09月24日 浏览量: 评论(0) 来源:《遗传标记在实验动物遗传质量控制中的应用》 作者:宋国华 责任编辑:yjcadmin

遗传检测技术是遗传质量控制的重要手段之一,现有的检测方法不能满足科学发展的需要。近年来,随着人类基因组研究的不断深入,有关SNP的研究越来越受到重视,但小鼠SNP研究,特别是将SNP应用于近交系小鼠遗传检测的研究比较少。为此,建立小鼠SNP遗传检测方法,并对SNP与生化标记位点多态性的关联性进行研究,进一步完善我国实验动物遗传检测技术,提高检测水平。

岳秉飞等采用单管双向等位基因专一性扩增方法建立小鼠SNP遗传检测方法,首先对5个国外品系的近交系小鼠的16个SNP位点进行了检测,并进行测序验证,同时设计双盲实验验证该方法的可靠性。结果5个小鼠品系的16个SNP位点都成功地进行了分型,与测序的结果完全一致。双盲实验通过3个SNP位点综合分析,可以准确地鉴别这5个小鼠品系。此外,我们对国内培育的4个品系的近交系小鼠也进行了检测,最终确定了4个品系的16个SNP位点等位基因,而且还绘制了9个品系小鼠的16个SNP位点的等位基因图谱。这些研究不仅为各小鼠品系的遗传鉴定和品系间的鉴别提供了实验依据,而且还为近交系小鼠遗传检测提供了新方法。对提高我国实验动物遗传检测技术水平,促进生命科学发展具有重要意义。

具体实例:小鼠SNP遗传检测方法的构建

一、实验材料

本研究选用BALB/cJ、C57BL/6J、C57BL/10J、C3H/HeJ、DBA/2J、NCPC/2、

NCPC/4、TAI、615 9个品系近交系小鼠,经遗传生化位点检测均合格。

二、实验方法

1.基因组DNA的提取  按照常规提取基因组DNA的提取的方法提取DNA,-20℃保存。

2.设计引物  根据SNP数据库中的SNP位点两侧序列利用Primer5.0软件设计引物P1、P2、MSP1、MSP2,引物MSP1、MSP2其3'末端分别与不同的SNP等位基因配对,为提高SNP检测的特异性,在其3'端倒数第三位人为引入了一个错配碱基。P1和MSP2、MSP1和P2分别扩增出长度相差100bp以上的特征片段。

3.SNP检测方法  在PCR反应管中同时加入4种引物(特异性引物MSP1、 MSP2的浓度为0.6μmol/L,引物P1、P2的浓度为0.4μmoL/L),10×PCR缓冲液2.5μl、dNTP(各2.5mmol/L)2μl,DNA聚合酶0.75~1.00U、DNA模板50~150ng,无菌超纯水补充体积至25μl。PCR反应程序为:94℃预变性5min、94℃变性30s,退火温度退火1min,72℃延伸1min,35个循环,72℃延伸7min,4℃保存。 PCR反应产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测,用生物电泳成像系统分析,根据凝胶上电泳条带判断SNP类型。

三、检测结果

由图6-1可以看出,每个位点都扩增出3条目的片段,即一条所有品系都有的片段,由引物P1、PZ扩增而得,起内对照的作用;表6-1为本实验检测的5个国外近交系小鼠16个SNP位点的等位基因型。两条特征片段,分别对应于不同的等位基因,根据特征片段的差异,可以很容易地确定每个品系的SNP位点等位基因。

本实验对国内近交系小鼠的16个SNP位点进行了检测,基本达到了国内外遗传检测要求,但作为新品系的鉴定及科学研究,还需进一步检测更多的SNP位点,以便提供更准确的实验动物遗传概貌。

四、讨论

SNP主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。Petkov等选择了28个SNP标记,这些标记覆盖了小鼠所有常染色体和X染色体,能区分所有的近交系小鼠,其结果显示该方法是一个快速、可靠及高效的遗传检测方法,这些SNP标记被用于随机检测已建立的群体中的所有种畜。SNP所表现的多态性只涉及单个碱基的变异,具有密度高、代表性、遗传稳定性等特点,能够全面地反映基因组的遗传及变异情况。随着研究的不断深入,我们相信SNP检测方法将在小鼠遗传质量控制中得到广泛的应用,发挥其独特作用。

目前国内小鼠遗传检测方法主要是皮肤移植法和生化标记基因法,但传统的皮肤移植法只能测出近交系小鼠中的基因型是否一致,而不能测出各品系是否保持着原有的遗传特性,且检测周期长,操作复杂。生化标记基因法检测的多是单基因遗传位点,且需要的试剂较昂贵。而本实验方法在1个反应管中,采用两个特异性引物同时测定SNP的3种可能等位基因类型,操作简便,易于推广。从DNA的提取、PCR扩增、凝胶电泳到检测,可在半个工作日内完成。与现有检测方法相比, SNP方法准备工作简单容易、快速;检测能达到高通量、自动化和低成本,能够满足大规模的要求。


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