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实验方法

如何高效复苏细胞?这四点要注意!

2020年12月30日 浏览量: 评论(0) 来源:瑞沃德 作者: 责任编辑:yjcadmin
摘要:每次复苏细胞都手忙脚乱?好不容易复苏的细胞竟然污染了?高效复苏细胞流程包括了①从液氮罐中取出冻存细胞,放入37℃水浴锅中融化,轻柔离心后收集细胞沉淀;②缓慢用移液枪吸去上清,加入适量浓度和体积的完全培养基,重悬细胞沉淀,转移至细胞培养皿或细胞培养瓶;③根据细胞培养皿或者培养瓶的体积,补足完全培养基,放入二氧化碳培养箱中培养观察。操作中的注意事项有小心取出冻存管、快速融化待复苏细胞、轻柔收集已复苏细胞、培养前,计数&活力检测。

每次复苏细胞都手忙脚乱?好不容易复苏的细胞竟然污染了?

今天教你如何有条不紊地高效复苏细胞!

细胞复苏流程

1、从液氮罐中取出冻存细胞,放入37℃水浴锅中融化,轻柔离心后收集细胞沉淀;

2、缓慢用移液枪吸去上清,加入适量浓度和体积的完全培养基,重悬细胞沉淀,转移至细胞培养皿或细胞培养瓶;

3、根据细胞培养皿或者培养瓶的体积,补足完全培养基,放入二氧化碳培养箱中培养观察。

 

操作中的注意事项

(一)、小心取出冻存管

许多小型液氮罐的设计是将细胞冻存在带盖的提篮中,提篮会浸没在液氮中。由于提篮中没有孔格的划分,细胞冻存管无法摆放整齐。取用细胞时候,实验人员经常需要逐一查看,寻找计划复苏的细胞。此过程耗时过久,可能会导致其他冻存管内的细胞受损。

一般大型液氮罐会配置成列的冻存架和细胞存储盒,取出冻存架和放回都需要平稳小心处理,避免带出大量液氮。罐内液氮较多时,可适当在罐口附近停留,等大部分液氮回流后再拎出。

注意

  • 液氮在室温下会快速气化吸热,溅到皮肤或者眼睛上会烫伤。从液氮罐中取细胞时,需要做好防护工作——戴好厚手套和护目镜。

  • 不要将冻存管丢入液氮罐,以防液氮溅出。

(二)、快速融化待复苏细胞

当找到准备复苏的冻存管后,不要着急放入水浴锅,先检查封口膜是否完整,如果贴了医用胶布,胶布是否有破损?因为一旦冻存管中有液氮流入,直接放入水浴锅中,管内压力骤升,可能导致冻存管炸裂,危及实验人员

复苏细胞的核心技术,简而言之就是快融。从液氮罐中取出的细胞,需及时放入37℃水浴锅,进行快速融化,期间需不停地轻柔摇晃冻存管。最好在两分钟内完全融化细胞。出于卫生考虑,有些细胞房没有水浴锅,所以很多复苏操作,需要在不同实验室进行。如果两个实验室距离较远,且实验室室温较高,可提前准备一只干净的烧杯,装入37℃的水作中间缓冲

注意

·        融化中不要让水浴锅中的水,流入冻存管中造成污染。

·        复苏过程中要格外注重无菌操作,经水浴锅融化后,需对冻存管消毒。最好同时更换手套和口罩,全程避免移液器接触管口及管壁。可以将冻存管放入无菌一次性PE手套中,再放入水中融化,避免污染也方便操作

(三)、轻柔收集已复苏细胞

收集细胞前,要将所用培养基提前配制预热并摆放整齐,避免现用现配耽误复苏进程,让刚复苏的细胞及时接触正常的生长环境。若冻存液中存在DMSO,请根据所用细胞对其敏感的程度,判断要不要离心弃除。

刚复苏的细胞状态比较脆弱,应避免多次吹打和离心。比如原代细胞在复苏融化后,尽量不要进行离心操作,直接补足培养基,使细胞分散均匀,等3-6小时,细胞贴壁后,进行换液处理。此方式也适用于其他冻存状态一般的细胞。

 (四)、培养前,计数&活力检测

复苏过程中,细胞计数必不可少。原则上,冻存前和复苏后,都需要对细胞进行计数和活率分析,判别冻存的效果和细胞复苏后的状态。

2018年9月,美国药典(USP-NF)出台了关于细胞冻存相关政策并明确指出,台盼蓝不能很好地识别刚复苏的细胞(细胞的种类和台盼蓝的浓度不同,对染色结果都有较大的影响),建议使用两种以上的方法进行细胞计数,如结合荧光染色计数法。


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