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实验方法

五指山猪近交系GH和GHR基因的原核表达

2021年01月06日 浏览量: 评论(0) 来源:《中国实验用小型猪》 作者:冯书堂 主编 责任编辑:yjcadmin

哺乳动物生长激素(GH)是一种由脊椎动物脑垂体分泌的多肽激素,具有调节身体生长、促进新陈代谢的作用。20世纪50年代中后期,国外学者先后报道了注射外源猪垂体生长激素取得了显著效果。但用脑垂体提取pGH成本太高,长期难以产业化。Evock首次用DNA重组技术在大肠杆菌(E.coli)中表达了重组猪生长激素,其生物活性与由脑垂体提取的生长激素相同(Evock等,1991)。90年代国内学者也用E.coli系统成功地表达了重组猪生长激素(苏悌之等,1990;余旭平等,1991)。由于pGH在养猪业上明显的经济效益,克隆及表达猪生长激素基因在生产实践上有着重要意义。

GH在组织和细胞水平发挥作用的第一步是和靶细胞膜表面GHR结合,由GHR介导将信号传入细胞内从而产生一系列的生理效应。GHR存在于细胞质膜,广泛分布于各种组织细胞内。目前在肝、心、肾、肺、脑、肠、软骨、骨骼肌、脂肪等组织及淋巴细胞、胸腺细胞中都证实有GHR的存在,其中以肝脏的含量最高(Kelly等,1991;Hocquette等,1989)。猪的GHR基因cDNA最早是由Goffi于1990年克隆得到的(Cioffi等,1990),并且猪与人的GHR cDNA有89%的同源性。Chowdhary将猪的GHR基因定位于16号染色体,并得到了一个线性连锁图谱:C9-FS-GHR-S0105(Chowdhary等,1994)。关于其他物种 GHR基因的表达研究较多(Leung等,1987),猪的GHR基因的表达研究相对较少。

本研究构建了WZSP近交系GH和GHR基因的原核表达载体,并进行诱导表达,探讨猪GH和 GHR融合基因在E.coli中的最佳表达条件,为进一步研究GH和GHR的功能奠定基础。

(一)实验材料

实验材料与主要仪器类同研究三(从略)。

表达菌BL21(DE3)由本实验室保存备用。原核表达质粒pET-28a(+)为MERCK公司旗下的Novagen公司产品,见图1-59。

主要试剂如下:

(1)30%聚丙烯酰胺母液:将29g丙烯酰胺和1g N,N'-亚甲双丙烯酰胺溶于60mL ddH2O中,加热至37℃溶解,定容至100mL,4℃避光保存备用。

(2)12%SDS聚丙烯酰胺(分离胶,10mL):3.3mL ddH2O,4mL 30%丙烯酰胺溶液,2.5mL浓

度为1.5mol/L的Tris(pH8.8),0.1mL 10%SDS,0.1mL 10%过硫酸铵,0.004mL TEMED。

(3)5%SDS聚丙烯酰胺(积层胶,3mL):2.1mL ddH2O,0.5mL 30%丙烯酰胺溶液,0.38mL浓度为1.0mol/L的Tris(pH6.8),0.03ml。10%SDS,0.03ml。10%过硫酸铵,0.003mL TEMED。

(4)二硫苏糖醇(DTT,1mol/L):转移100mg的DTT至微量离心管,加0.65mL的ddH2O配制成1mol/L的DTT贮存液。或在5g的原装瓶中加32.4mLddH2O,溶解后使用0.22μm滤器过滤除菌,分成小份贮存于-20℃。

(5)2×SDS凝胶加样缓冲液:100mmol/L Tris·HCl(pH6.8),200mmol/L DTT,4%SDS(电泳级),0.2%溴酚蓝,20%甘油。

(6)5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液(pH8.3):7.55g Tris,47g甘氨酸,25mL 10%SDS,加ddH2O溶解定容至500mL。

(7)考马斯亮蓝染色液(100mL):45mL甲醇,45mL ddH2O,10mL冰乙酸,0.25g考马斯亮

蓝R250。

(8)脱色液(1000mL):450mL甲醇,450mL ddH2O,100mL冰乙酸。

(9)Kan:用灭菌去离子水溶解成储存浓度100mg/mL,-20℃保存备用。

(10)工具酶和T4连接酶均购自Takara公司。

(二)实验方法

1.原核表达载体的构建

(1)五指山猪近交系GH基因原核表达载体的构建  利用研究三获得的WZSP近交系GH基因的克隆连接载体-WZSPGH-pGEM质粒为模板,设计引物BPGH/EPGH(表1-47),用ExTaq酶进行扩增,扩增出两端分别加有BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点的DNA片段,并再次利用pGEM-T-easy载体进行克隆,经测序验证无氨基酸改变后,利用BamHⅠ和EcoRⅠ分别双酶切该重缉质粒和原核表达载体 pET-28a(+),并将外源片段及线性化的pET-28a(+)进行凝胶纯化回收、连接,并将连接产物转化表达型宿主菌BL-21,菌落PCR鉴定后提质粒进行双酶切验证,并将该重组质粒命名为 WZSPGH-pET-28a(+)。

(2)五指山猪近交系GHR基因原核表达栽体的构建

利用研究三获得的WZSP近交系GHR基因的克隆连接载体-WZSPGHR~pGEM质粒为模板,设计引物SPGHR/NPGHR(表1-47),用LA Taq酶进行扩增,扩增出两端分别加有SalⅠ和NotⅠ酶切位点的DNA片段,并再次利用pGEM-T-easy载体进行克隆,经测序验证无氨基酸改变后,利用SalⅠ和NotⅠ分别双酶切该重组质粒和原核表达载体pET-28a(+),并将外源片段及线性化的pET-28a(+)进行凝胶纯化回收、连接,并将连接产物转化表达型宿主菌BL-21,菌落PCR鉴定后提质粒进行双酶切验证,并将该重组质粒命名为WZSPGHR-pET-28a(+)。其技术路线如图1-60所示(以 WZSP GHR基因为例)。

PCR反应体系及扩增程序如下:

WZSP GH基因PCR反应体系:2.5μL 10×Buffer,1μL Former primer(10μmol/L),1μL Reverse primer(10μmol/L),2μL dNTPs(2.5mmol/L),0.125μL Ex Taq,0.5μL质粒DNA模板, ddH2O补足至25μL。

WZSP GHR基因PCR反应体系:2.5μL 10×Buffer,1μL Former primer(10μmol/L),1μL Reverse primer(10μmol/L),4μL dNTPs(2.5mmol/L),0.25μL LA Taq,0.5μL质粒DNA模板,ddH2O补足至25μL。

经过梯度PCR扩增仪对各个引物退火温度的摸索,确立了PCR反应程序:

PGH的反应程序为:94℃预变性5min→94℃变性30s→65℃退火30s→72℃延伸1min(30cycles)→72℃延伸10min→4℃保存。

PGHR的反应程序为:94℃预变性5min→94℃变性1min→66℃退火30s→72℃延伸2min(30cycles)→72℃延伸10min→4℃保存。

PCR反应程序结束后,1%琼脂糖凝胶检测PCR扩增产物。

2.原核诱导表达  进行原核诱导表达的操作步骤如下:

(1)挑取含重组质粒的菌斑至2mL LB(含Amp 50μg/mL)中37℃培养过夜。

(2)按1:50比例稀释过夜菌,一般将1mL菌加入到含50mL LB培养基的250mL锥形瓶中,37℃震荡培养至对数生长期,A550=0.5~1.0(最好0.6,大约需2~3h)。

(3)取部分液体作为未诱导的对照组,余下的加入IPTG诱导剂至终浓度1mmol/L作为实验组(也可设IPTG浓度梯度),两组37℃继续震荡培养。

(4)在诱导的不同时间(如:0.5、1、2、3、4、5h)分别取1mL放入EP管中。待全部收集完毕,室温高速离心1min收获沉淀,用100μL 1×SDS凝胶上样缓冲液重悬,混匀,100℃煮沸3min。

(5)然后室温12000g离心1min,冰上放置,取上清液作为样品进行点样。

(6)8~15V/cm电泳,至溴酚蓝迁移到分离胶底部。

(7)考马斯亮蓝染色,观察表达产物。

(三)结果与分析

1.原核表达载体的酶切鉴定  将WZSPGH-pET-28a(+)表达质粒用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切,WZSPGHR-pET-28a(+)表达质粒用SalⅠ和NotⅠ双酶切,然后经1%琼脂糖凝胶电泳后,可以观察到目的分子量标准附近均切出条带如图1-61和图1-62。

2.表达质粒在大肠杆菌中的表达结果  以BL21(DE3)为表达菌在LB培养基中进行诱导表达,并以空载体(Null)作为阴性对照,分别在诱导后0、1、2、3、4和5h提取包涵体,并进行SDS-PAGE电泳检测。由图1-63可以看出,经IPTG诱导1、2、3和4h后,重组质粒在大肠埃希氏菌中均有表达,在预期分子量24800前后各时间段有蛋白带的特异性增加,以诱导3h的表达量最高,经Bandscan4.30软件扫描发现特异蛋白带约占菌液总蛋白的20%。在预期分子量70800前后各时间段并无蛋白带的特异性增加(图1-64)。究其原因可能有二:其一真核生物蛋白在原核中表达时,会存在密码子偏爱;其二,该蛋白在原核生物中不表达。

(四)讨论

1.五指山猪近交系GH基因的原核表达  改建和去除信号肽序列后的WZSP近交系GH基因克隆入原核表达载体pET-28a(+)的BamHⅠ和EcoRⅠ位点,由于克隆位点上游存在His·Tag/thrombin融合肽基因,所以WZSPGH-pET-28a(+)表达的是融合蛋白,分子量在25000左右,说明表达产物的分子量与上述理论数据相符。

众多学者对猪GH的原核表达进行了研究,其中因为选择的原核表达载体的不同,其表达量也有所不同。白俊杰等(2001)采用原核表达载体pBV220构建猪GH基因表达载体,融合蛋白表达量约占细胞总蛋白的20.5%。李凤等(2005)构建pGEX1-λT-pGH原核表达载体,经LPTG诱导4h后表达量最高达18.6%。朱江等(2005)采用与本实验相同的pET-28a(+)原核表达载体对猪GH基因进行原核表达,其表达量约占大肠杆菌胞浆蛋白的17%左右,而本研究中融合蛋白的表达量约占菌液总蛋白的20%。这表明外源基因的表达水平除了与表达载体的选择有关外,还与不同中外源基因的密码子偏爱性也关系密切(白俊杰等,2000)。

另外,外源基因在大肠杆菌内表达的研究中,诱导剂浓度和诱导时间的影响是十分重要的。只有诱导时间和IPTG的诱导条件最佳时,才能获得较高的表达量。IPTG是一种表达调控物质,对于不同的基因,它诱导表达的条件不一样。即使是同一种基因,在不同的表达体系中,它的诱导表达条件也不一样。本实验在优化了IPTG浓度和诱导时间对产物的影响后,筛选出了WZSP近交系GH基因在大肠杆菌中最佳诱导条件为:诱导时间3h,IPTG浓度为1.0mmol/L。经Bandscan(4.30)软件扫描发现, WZSP近交系GH基因特异表达产物相对含量较高,约占菌液总蛋白的20%,证明本试验构建的GH基因原核表达载体能高效表达融合蛋白,不仅使今后大量获取重组WZSP GH成为可能,也有利于对其生物学作用进行更深入的研究。

2.五指山猪近交系GHR基因的原核表达  经酶切、测序验证,通过研究成功构建了WZSP近交系 GHR基因的原核表达载体,并在E.coli.表达菌BL21(DE3)中进行诱导表达,然而SDS-PAGE电泳检测,并无特异性条带出现,经分析可能存在以下几个方面的原因:

(1)在原核细茵中具有密码子偏爱性  蛋白质翻译过程中,tRNA携带相应的氨基酸到核糖体上的 A位,如果结合到A位的tRNA与该密码子相对应,就可进行肽链的合成与延伸,如果不合适,则将使蛋白翻译停顿,更换并直接找到正确的tRNA。原核生物中,由于不同tRNA含量的差异导致了对不同密码子的偏爱性。对于相应tRNA丰富的密码子,正确的氨基酸会很快连接上,而相应tRNA稀少的密码子,要经过多次相互辨认才能找到正确的tRNA。如果相同的稀有密码子连续出现,就会抑制蛋白质合成,甚至发生密码子错配。统计后发现,AGA、AGC、AUA、CCG、CCT、CTC、CGA和 GTC等8种密码子是大肠杆菌的稀有密码子(Grosjean等,1982)。如果外源基因含有较高比例的稀有密码子,其表达效率往往不高。而在WZSP近交系GHR的编码区共有69个稀有密码子,其中CCT(14)、AGC(11)和CTC(11)最多。在此情况下,按照常规的实验方法,想得到原核表达产物就显得比较困难了,因此才出现了原核表达无结果的现象。

(2)生长因子不能在单细胞生物中表达  由于GHR是一个细胞生长因子,它存在于多细胞生物中。然而在大肠杆菌这些单细胞生物中,若只考虑自身而不考虑对其周围生物的影响来说,是没有必要存在这些细胞因子的。因为它们是通过彼此之间的竞争而得以生存的,如果存在,势必造成自身的完全灭亡,这对于单细胞生物来说是不现实的(Curtin等,2003)。而FN3只存在于真核生物中,在一定程度上也证实了这一结论。

当然,没有表达产物,其原因也是多方面的,可能还与载体的选择、培养的条件等有关,这里就不再一一分析。

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