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实验方法

五指山猪近交系GH和GHR基因的真核表达

2021年01月11日 浏览量: 评论(0) 来源:《中国实验用小型猪》 作者:冯书堂 主编 责任编辑:yjcadmin

为了更好地研究和利用猪GH,人们除了直接从脑垂体分离GH外,还应用生物工程技术,在大肠杆菌中进行表达,但大肠杆菌表达系统属原核表达系统,它缺乏对表达的真核蛋白的翻译后加工功能,如信号肽的切除、蛋白质的甲基化、糖基化和磷酸化、精确的蛋白折叠等,这使得表达的蛋白的生物活性得不到保障(Maeda等,1985;O'Reilly等,1994)。到目前为止,人们已通过基因重组技术在大肠杆菌原核表达系统、鼠胚胎成纤维细胞、杆状病毒表达载体系统和昆虫细胞中的表达进行了研究(O'Mahony等,1990;欧阳菁等,2002)。本研究采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术克隆了WZSP近交系GH cDNA,并构建了真核表达质粒,对WZSP近交系GH基因在PK-15细胞中的表达进行了研究。

JAK家族有4个成员:JAK1、JAK2、JAK3和Tyk2。GH与GHR结合后主要激活JAK家族中的JAK2(Janus kinase2),JAK2是一类蛋白磷酸酶,能促进蛋白质酪氨酸残基的磷酸化,为重要的信号传递分子。GH分子上有两个不同的GHR结合位点,每个位点可结合一个GHR,故一个GH分子能结合两个GHR分子。GH与GHR结合,GHR二聚体形成后,JAK2的酪氨酸残基迅速发生磷酸化从而被活化,激活的JAK2使自身及GHR磷酸化,并同磷酸化的受体一起将GH信号进一步向下游传递。JAK2的激活不仅是GH信息在细胞内传递的第一个环节,而且是关键的环节。关于其他物种 GHR基因的表达研究较多(Tanaka等,1995;Jean等,1997;Takeshi等,1998),猪的GHR基因的表达研究相对较少。

本研究构建了WZSP近交系GH和GHR基因的真核表达载体,并在PK-15细胞中进行表达,并对GHR下游的JAK2基因的表达情况进行了研究,旨在探讨WZSP近交系GHR基因突变对GH信号转导的影响,为进一步研究GHR的功能奠定基础。

(一)实验材料

实验材料为研究二中论述所构建的WZSP近交系GH和GHR基因的克隆连接载体。主要仪器为常规分子生物学通用设备(从略)。

克隆菌DH5a由本实验室保存备用。大肠杆菌ER2925获赠自赵永贞。克隆用质粒pGEM@-T Easy vector,为Promega公司产品,供TA克隆用。真核表达用荧光表达质粒pEGFP-C1,BD Biosciences Clontech公司,质粒图谱见图1-65。用于表达的真核细胞为猪的肾上皮细胞(PK-15),由王恒惠赠。

主要试剂如下:

(1)DMEM培养液的配置:DMEM干粉13.400 0g(1袋)加丙酮酸钠0.1100g,NaHCL)33.7000g,三蒸水溶解,定容到1000mL(1mol/L NaOH调pH 7.2~7.4),0.229μm滤膜过滤除菌,4℃冰箱保存,若存放时间超过2周,补加1mmol/L谷氨酰胺。

(2)胎牛血清(FCS):购自Gibco公司,用前56℃,30min水浴灭活。

(3)PBS磷酸缓冲液的配置:NaCl 70.000g,KCl 0.370g,KH2PO4 0.290g,Na2HPO4·12H2O

0.300g,加三蒸水定容至1000mL,高压灭菌密封后,4℃冰箱保存。

(4)双抗贮存液的配置:链霉素4支(100万IU),青霉素5支(80万IU)溶于400mL三蒸水中。

(5)0.25%胰蛋白酶溶液配置:胰酶2.500g,G1.000g,EDTA 0.400g,Tris 3.000g,NaCl7.000g,KCl 0.370g,KH2PO4 0.290g,Na2HPO4·12H2O 0.300g,酚红1mL溶于1000mL五蒸水中,0.22μm滤器过滤除菌,4℃保存。

(6)细胞生长液:在DMEM培养液中加入10%的胎牛血清,100U/mL青霉素,100μg/mL链霉素,4℃保存备用。

(7)细胞冻存液的配置:10mL DMSO+90mL FBS,0.22μm滤膜过滤除菌,分装,贮存于-20℃冰箱中。

(二)实验方法

1.真核表达载体的构建  引物的设计根据pEGFP-C1载体的多克隆位点和猪GH和GHR基因的编码区序列,上、下游引物5'端分别加有酶切位点(酶切位点序列加粗并加下划线,如表1-48所示),并在酶切位点识别序列外侧分别加上2个保护碱基,以利于酶切反应的顺利进行。分别以WZSP近交系GH和GHR基因克隆载体为模板进行PCR扩增。PCR反应体系及扩增程序如下所示。PCR产物的纯化按照试剂盒说明书进行。PCR产物和载体质粒的双酶切体系:反应总体积为20μL,其中含有经过质粒提取获得的pEGFP-C1载体DNA 8μL,10×Buffer 2μL,两种限制性内切酶各1μL,双蒸水8μL。37℃酶切过夜后纯化回收。连接反应,转化大肠杆菌,37℃培养过夜,挑菌斑摇菌后,菌液PCR鉴定,小提质粒及双酶切鉴定均参照研究四。鉴定后采用天根公司无内毒素质粒大提试剂盒提取质粒备用。载体构建过程见图1-66。

PCR反应体系及扩增程序如下:

WZSP GH基因PCR反应体系:2.5μL 10×Buffer,1μL Former primer(10μmol/L),1μL Reverse primer(10μmol/L),2μL dNTPs(2.5mmol/L),0.125μL Ex Taq,0.5μL质粒DNA模板, ddH2O补足至25μL。

WZSP GHR基因PCR反应体系:2.5μL 10×Buffer,1μL Former primer(10μmol/L),1μL Reverse primer(10μmol/L),4μL dNTPs(2.5mmol/L),0.25μL LA Taq,0.5μL质粒DNA模板, ddH2O补足至25μL。

经过梯度PCR扩增仪对各个引物退火温度的摸索,确立了PCR反应程序:

PGH的反应程序为:94℃预变性5min→94℃变性30s→66℃退火30s→72℃延伸1min(30cycles)→72℃延伸10min→4℃保存。

PGHR的反应程序为:94℃预变性5min→94℃变性1min→65℃退火30s→72℃延伸2min

(30cycles)→72℃延伸10min→4℃保存。PCR反应程序结束后,1%琼脂糖凝胶检测PCR扩增产物。

2.真核表达

(1)细胞培养与传代

①培养:PK-15细胞为猪的肾上皮细胞株,亦为贴壁培养的细胞系,加明胶或不加明胶都可正常生长。PK-15细胞通常以5×10000/ml。的浓度培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中。在37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中培养。

②换液:12h后观察细胞贴壁生长状况,一般于第二天换液,随后隔天换液,逐天观察,待细胞铺满80%~90%培养瓶后(亦即形成细胞单层),即可直接用细胞培养液稀释2~3倍,传代培养。

③传代:当细胞达到80%~100%汇合时便可进行传代。先用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液冲洗贴壁细胞3遍,去除血清和脱落的组织块及死细胞。然后加入0.25%胰酶消化液约2mL作用1~3min,倒置显微镜下观察细胞质收缩变圆,即可倒掉消化液,继续作用约1min。轻敲瓶底使成PK-15细胞脱落瓶壁,加入DMEM培养液终止消化。充分吹打使细胞团成为单细胞悬液,传入新鲜培养瓶中继续培养,一般一瓶细胞可以传2~3瓶。

(2)细胞冻存

①消化:哺乳动物细胞培养2代后,选择长至80%~90%汇合生长的旺盛细胞,弃去培养瓶中的原DMEM培养液,用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液洗3次,加入胰酶消化液,作用约1~3min,弃去胰酶消化液,再稍微作用约1min,轻敲瓶底细胞层出现断裂,加入培养液终止消化液的作用。

②计数:用细胞计数板计算冻存细胞总数。

③收集细胞:用吸管将其吹打成单细胞悬浮液并将其转移到离心管,1000r/min离心10min。

④分装:弃去上清液,用1mL冻存液(含10%DMSO的培养液)重悬细胞,分装于冻存管中。一般一个50mL培养瓶的细胞可以冷冻2管。

⑤冷冻过程:将冷冻管中的细胞在-20℃冰箱冷冻2~3h后,转入-80℃超低温冰箱中过夜保存,第二天转入液氮中长期保存。细胞悬液的冷冻速度对冷冻效果的影响很大,多数细胞以每分钟下降1℃的速度降至-20℃,冻结均可获得满意效果。

(3)细胞复苏

①解冻:从液氮中取出冻存管,立即放入38℃温水中不停搅动,令其快速解冻,时间控制在1min内。

②接种细胞:将细胞悬液移入离心管中,加入等体积细胞培养液,立即放入离心机中,1000r/min离心10min,弃去上清液,加入新鲜培养液,充分吹打接种到预先2h涂有明胶的培养瓶中,37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱培养。

(4)细胞计数  在细胞培养过程中,需进行细胞计数以确定细胞接种密度和数量以及了解细胞存活率和增殖度。

①计数板的处理:用无水乙醇或95%乙醇溶液冲洗计数板后,用绸布或擦镜纸擦净,另准备干净的盖玻片一张,放在计数板上面。

②计数:用无菌吸管吸取一滴细胞悬液(细胞悬液也可先进行稀释,计算时应乘以稀释倍数)从计数板边缘缓慢滴入,使之充满计数板和盖片之间的空隙。注意不要使液体流到旁边的凹槽中或带有气泡,否则重做。稍候片刻,将计数板放在低倍镜下(10×10)观察计数。

③计数方法:计算计数板的四角大方格(每一个大方格又分16个小方格)内的细胞数。计算时,只计数完整的细胞,若聚成一团的细胞则按一个细胞进行计数。在一个大方格中,如果有细胞位于线上,一般计上线而不计下线细胞。两次重复计算的误差不应超过±5%。计完数后,需要换算出每毫升悬液中的细胞数。由于计数板中每一方格的面积为0.01cm2,高为0.01cm,这样它的体积为0.001cm3,即0.1mm3,由于1mL=1000mm3,所以每一个大方格里的细胞数×1000=细胞数/mL,故可按下式计算:细胞数/mL=(4个大方格细胞总数/4)×10000。如计数前已稀释,再乘稀释倍数。

(5)转染  将猪肾细胞PK-15在含有10%胎牛血清的DMEM培养基的细胞培养瓶中培养。其培养箱条件为37℃、5%的CO2。当细胞处于对数生长期时,用PBS洗细胞一遍后,加入2mL胰酶,37℃消化5min,倒掉胰酶,向培养瓶中加入DMEM细胞生长培养基并用吸管吹打细胞使其尽量以单个细胞的形式存在。将获得的细胞悬液一部分均匀分到放有盖玻片的六孔板中,另一部分继续留在培养瓶中,在37℃、5%CO2培养箱中培养。

当六孔板中的细胞达到60%汇合率时进行转染。首先将4μg质粒DNA与10μL Lipofectamine TM2000分别加入250μL不含血清和抗生素的DMEM培养基中,轻轻混匀静置5min后再将两者混匀,室温放置20min,将转染液加入六孔板中,轻轻混匀后放入CO2培养箱于37℃温育4~6h,弃去转染液加入含血清的DMEM培养基继续培养。转染后36~48h收集细胞。

(6)细胞中总RNA的提取  六孔板中每孔直接加入1mL TRIZOL,吹打均匀,并将所得混合液移到1.5mL的EP管中,15~30℃温育5min,其后续步骤同组织总RNA的提取。

(7)细胞中总RNA的反转录  以细胞总RNA为模板,实验方法同五-(二)-2-(1)。

(8)PCR扩增及分析  以细胞总RNA反转录产物为模板,采用上文中特异引物各自扩增目的基因,然后分别采用β-actin和JAK2基因所设计的特异引物进行扩增。在目的基因表达检测之前,PCR扩增看家基因β-actin来检测cDNA质量。引物序列及PCR反应程序见表1-49。PCR反应体系:2.0μL 10×Buffer,0.4μL Former primer(10μmol/L),0.4μL Reverse primer(10μmol/L),0.3μLdNTPs(10mmol/L),0.3μL rTaq,1μL质粒DNA模板,ddH2O补足至20μL。2.0%琼脂糖凝胶检测PCR产物。采用Kodak凝胶成像系统对电泳结果进行光密度分析。通过JAK2基因与β-actin基因的光密度比值来计算JAK2的相对表达量,每组PCR反应重复3次,采用统计分析软件SPSS 11.5中的单因素ANONA程序进行数据分析。

(三)结果与分析

1.真核表达载体的酶切鉴定  将构建好的WZSPGH-pEGFP-C1表达质粒用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切,WZSP近交系和大白猪GHR-pEGFP-C1表达质粒用SalⅠ和XbaⅠ双酶切,然后经1%琼脂糖凝胶电泳后,可以观察到目的分子量标准附近均切出目的条带,见图1-67和图1-68。经测序验证无移码突变,表明表达载体构建成功。

2.真核表达  将pEGFP-C1空载体、WZSP近交系GH真核表达载体、WZSP近交系和大白猪 GHR基因真核表达载体4种质粒转染猪肾细胞PK-15,经过对质粒浓度和脂质体浓度进行优化,发现4μg质粒DNA与10μL LipofectamineTM 2000的浓度比例转染效率较高,见图1-69所示。

3.细胞RT-PCR  上述4种质粒转染后24h后收集细胞,提取细胞总RNA,然后反转录为cDNA,采用上文中特异引物能各自扩增到与目的基因大小相同的片段(图1-70),然后以此为模板扩增的看家基因β-actin电泳结果见图1-71,可见cDNA模板质量较好,浓度基本一致。以4种cDNA为模板扩增JAK2基因片段,并以此扩增结果与β-actin基因的光密度比值来分析JAK2基因的表达量,JAK2电泳图及分析见图1-72,由图可以发现大白猪GHR基因真核表达载体转染细胞JAK2基因的表达量显著高于其他三种质粒(P<0.05)。

(四)讨论

1.五指山猪近交系GH基因真核表达  国内学者对猪GH基因的真核表达进行了一系列研究。陈清轩等(1997)用羊金属硫蛋白启动子(SMT)和猪生长激素基因(PGH)构建成可调控的表达载体pSMT- PGH,将其用于转基因动物研究,结果发现该表达载体具有促进转基因动物生长和提高某些经济指标的作用。欧阳菁等(2002)将 PCR扩增得到的pGH基因插入到带有polh启动子和gp67强信号肽序列的杆状病毒转移载体pAcGP672A中,构建重组质粒pGP67pGH,并转染Sf9细胞进行表达,最终获得pGH融合蛋白。刘燕飞等(2005)将pGH cDNA定向插入真核表达载体VR1020,构建了重组真核表达质粒VpGH并利用脂质体法转染哺乳动物细胞COS7,并证实pGH基因COS7细胞中得到正确表达。

同pET-28a(+)原核表达载体一样,pEGFP-C1也是一个融合表达载体,并含有GFP完整编码框,其C端含多克隆位点,可与外源基因连接,表达GFP融合蛋白。这种蛋白既有绿色荧光蛋白的特征,又有外源蛋白的特征,具有荧光特性稳定、检测方便、无种属特异性等优点,对受体细胞基本无毒害,是研究外源基因表达的良好工具。WZSP近交系GH基因全长cDNA两端分别加EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点,经上述两种酶切后连接入同样经双酶切的pEGFP-C1表达载体中,经双酶切鉴定和测序验证,证实WZSP近交系GH基因真核表达载体WZSPGH-pEGFP-C1构建成功,并转染PK-15细胞,经RT-PCR检测目的基因得到正确转录和表达,为进一步研究其功能奠定了基础。

2.GHR基因真核表达  GHR是已知的细胞因子受体家族中第一个被克隆的受体,这个家族包括 GHR、PRLR和leptin受体,也包括大部分白介素因子、干扰素α/β/γ、促红细胞生成素、白血病抑制因子等。比较GHR与PRLR及上述细胞因子受体,可发现这些受体的一级结构有四个共同特征(Roupas等,1994;Kelly等,1994;Ihle,1994):①在受体的N端有两对保守的半胱氨酸(Cys)残基;②除GHR外,在胞外域的近膜部有WSXWS结构,GHR中为保守的YGZFS模块所取代;③胞内无内在的Tyr激酶活性,无ATP结合结构域,但近膜区存在一个富含脯氨酸序列(7-amino acid Praline-rich sequence);④它们都可经由Jak-Stat途径介导信号。国外学者对GHR基因做了大量的研究。Hauser等(1990)通过制备特异牛GHR cDNA探针检测到牛肝脏中GHR表达量明显高于肾脏、垂体前叶和乳腺组织。Amir等(1992)从人皮肤中克隆得到GHR cDNA,与人肝脏GHR完全同源,制备探针检测在人皮肤成纤维细胞中呈现高表达量,半定量PCR分析表明,黑素细胞和皮肤成纤维细胞GHR表达量相当,表明人皮肤细胞可以作为研究GH和GHR功能的工具。Takeshi等(1998)克隆并分析了家鸽的GHR cDNA,预测蛋白由611个氨基酸组成,包含信号肽、跨膜区和富含脯氨酸的 box-1框,并在COS-7细胞中进行了表达研究。Jean等(1997)从恒河猴肝脏组织中克隆得到GHR基因,预测成熟GHR包含622个氨基酸,且与人GHR同源性高达94.1%,转染293细胞并发现人GH能激活下游信号蛋白JAK2和GHR的磷酸化。

国内研究人员对GHR基因的研究主要集中在SNPs和组织表达量的检测。生长激素受体基因的外显子10上发现单核苷酸多态性,测序结果显示:所扩增GHR外显子10部分片段共有5处碱基突变,并导致3处氨基酸替代,其中622bp Pro/Ser(脯氨酸/丝氨酸),650bp Asn/Thr(天冬酰胺/苏氨酸),730bp Ser/Gly(丝氨酸/甘氨酸),经最小二乘法分析表明:该单核苷酸多态对牛生长性状有显著影响(秦巧梅等,2007)。赵高锋等(2007)也发现了秦川牛GHR基因外显子10存在SNPs,导致两处氨基酸替代,其中天冬酰胺替换苏氨酸与秦巧梅等研究结果一致,对该SNPs进行相关性分析表明其能显著影响秦川牛的生产性状。上述研究结果表明GHR基因有可能作为牛生长性状的候选基因。动物的生长离不开神经内分泌调节,其中起决定性作用的是GH与靶器官细胞膜上GHR相结合,从而激发一系列细胞内机制,因此研究各种组织器官的GHR基因表达的发育性变化具有重要的意义。周杰等(2003)通过相对定量RT-PCR方法研究脂肪组织中GHR的基因表达,分析其发育性变化,结果表明:脂肪组织中GHR mRNA的表达有明显的发育性变化及品种差异,二花脸母猪GHR mRNA水平出生时较低,45日龄达到高峰,之后维持稳定;二花脸公猪GHR mRNA水平在出生时较高,至45日龄达到最高值,之后显著下降,但总体上没有性别差异;大白猪公猪GHR mRNA水平极显著低于二花脸公猪(P<0.01)。不同日龄猪下丘脑和垂体GHR mRNA水平进行相对定量RT-PCR分析发现:下丘脑 GHR mRNA表达呈明显的时序性变化,呈先增高后降低的趋势;而垂体GHR mRNA表达相对稳定,品种和年龄间差异不显著,揭示GH的负反馈作用位点可能主要在下丘脑(徐金先等,2004)。

由于GHR基因CDS编码区较长,接近2000bp,本研究在构建GHR基因的真核表达载体时可供选择的内切酶就不多,最终选择了SalⅠ和XbaⅠ两种酶,但由于XbaⅠ酶切位点在真核表达载体上被甲基化保护,因此本试验先将pEGFP-C1质粒转化入大肠杆菌ER2925(大肠杆菌ER2925具有去甲基化的特点),然后提取pEGFP-C1质粒进行双酶切并与GHR基因进行连接,再次转化提取质粒双酶切鉴定后,成功构建了大白猪和WZSP近交系GHR基因的真核表达载体,并转染猪肾细胞PK-15进行表达,经RT-PCR检测GHR基因得到正确的转录和表达,并随后对下游的信号基因表达情况进行了检测。

3.JAK2表达量的检测  JAK是一类蛋白磷酸酶,能促进蛋白质酪氨酸残基的磷酸化,为重要的信号传递分子,它与GH、红细胞生成素、催乳素、白细胞介素(IL)-3、IL-5、粒细胞集落刺激因子和γ干扰素(γ-IFN)等物质细胞内的信号传递有关。JAK家族有4个成员:JAK1、JAK2、JAK3和 Tyk2(Smit等,1999)。GH与GHR结合后主要激活JAK家族中的JAK2。GH发挥生理作用的第一步是先与2分子GHR结合,引起GHR结构发生变化并二聚体化,提高对JAK2的亲和性,结合并激活JAK2;JAK2被激活后使自身酪氨酸磷酸化并磷酸化GHR,提高GHR对大量信号蛋白的亲和性,这些信号蛋白随后被磷酸化。在GH和GHR引发的信号转导过程中,虽然存在着一种不依赖于JAK2的L型钙离子通道途径,如激素PRL和Src家族激酶,但几乎所有的下游信号途径都是经过JAK2诱导的。由JAK2诱导的下游信号包括:①信号转导和转录激活因子Stat蛋白可以调控大量GH依赖性基因的转录;②IRS蛋白能够招募PI3'激酶和SHP2,可以调节细胞代谢和基因转录;③She适配蛋白是Ras-MAP激酶信号途径的第一步,该信号途径可以调控各种细胞蛋白;④SH2-B蛋白能够激活 JAK2或其他特异的信号途径。GHR/JAK2复合物募集的这些信号分子启动调节特定基因转录活性的信号通路、细胞代谢酶和肌动蛋白细胞骨架分子,最终促进机体生长和糖类、脂类和蛋白质的代谢(Christin Carter-Su等,2000)。

Argetsinger等(1993)最先通过免疫学方法鉴定出GH依赖性的GHR和JAK2复合物,JAK2的激活和JAK2及GHR的酪氨酰磷酸化作用,证明配体激活的酪氨酸激酶参与了GH胞内信号转导。 Witthuhn等(1993)鉴定出JAK2是促红细胞生成素和白介素-3受体的信号分子。目前的研究结果表明,多种细胞因子、生长因子、激素等的信号转导途径中都有JAK激酶和STAT蛋白的参与,因此它们在这些因子介导的免疫反应和免疫调控中具有重要的作用。JAK2基因突变对造血细胞的增殖、分化(IL-3、GM-CSF、EPO等介导),急性期反应(IL-6介导),抗病毒免疫(IFNγ介导)等功能具有重要影响(Pellegrini等,1997)。在正常生理条件下,红细胞生成、分化、成熟受红细胞生成素(EPO)的调控。EPO与红细胞膜上受体(EpoR)相结合,使之发生构象改变,使得胞浆内与EpoR结合的JAK2磷酸化激活,继而活化胞浆内多种信号转导因子,如STAT、MAPK、PI3K等,维持红系祖细胞的存活,并促进其增殖与分化(Miura等,1994)。JAK2在多种造血生长因子受体信号转导中发挥关键作用,JAK2基因突变体(JAK2-V617F)在骨髓增殖性疾病中发生率较高,因而可作为骨髓增殖性疾病的候选基因(Jelinek等,2005)。另有研究发现JAK2/STAT3通路与大鼠血管平滑肌细胞增殖、凋亡密切相关,该通路调控了细胞内信号传导机制,最终通过其下游靶基因影响大鼠血管平滑肌细胞的增殖与凋亡(唐梅等,2006)。廖志勇等(2004)将豚鼠GHR在COS-7细胞中成功表达后,采用定点突变方法研究了豚鼠生长激素受体分子中一些氨基酸残基的替代对其介导的生物功能的影响。研究结果表明,豚鼠GHR 168位的酪氨酸和332位的丝氨酸分别用在其他种属GHR中高度保守的精氨酸和酪氨酸的取代后,则明显地影响着豚鼠GHR介导的GH诱导的生理效应。突变体在不影响GHR表达和配体结合的情况下,却较大程度地影响着GH诱导的蛋白质合成、脂生成和 JAK2的磷酸化。相对野生型豚鼠GHR,突变体gpGHRY168H提高了GH诱导的蛋白质合成,而降低了GH刺激的脂生成和JAK2的酪氨酸磷酸化;突变体gpGHRS332Y也降低了脂生成,而提高了蛋白质的合成和JAK2的酪氨酸磷酸化。研究结果表明,豚鼠GHR的功能更为侧重于机体代谢的调节,而这一结果可能是为受体后的信号或信号强度的改变所致,这为解释豚鼠对GH应答的异常提供了实验依据。

本研究构建了WZSP近交系GH和GHR基因真核表达载体,作为对比,构建了大白猪GHR基因真核表达载体,将上述构建成功的真核表达质粒转染猪肾细胞PK-15,RT-PCR证实获得正确转录和表达,并用相对定量RT-PCR方法研究细胞中JAK2的基因表达。结果发现:转染大白猪GHR基因的细胞JAK2基因表达水平显著高于转染其他三种质粒的细胞(P<0.05),转染WZSP近交系GH基因的细胞的JAK2基因表达水平略高于转染pEGFP-C1质粒的细胞,而转染WZSP近交系GHR基因的细胞JAK2基因的表达水平最低,这必将会影响下游的信号转导,从而削弱GH的促生长作用。推测 WZSP近交系GHR基因所发现的氨基酸替换可能会影响JAK2基因的表达,具体影响的机制有待进一步深入研究。

六、结论

本研究围绕探索WZSP近交系矮小性机理,开展了部分与生长发育相关的基因分子生物学特性研究。得出了如下主要结果:

1.首次克隆得到

(1)WZSP近交系GH全长cDNA(已登录GeneBank,登录号为DQ415717),预测其编码蛋白包括216个氨基酸,分子量为24400,等电点为7.175。

(2)WZSP近交系GHR基因,GHR基因编码区长1917bp(已登录GeneBank,登录号为 DQ422962),该编码区编码一个拥有638个氨基酸的蛋白质,其分子量为711000,等电点为4.509,是一个偏酸性蛋白质。

(3)WZSP近交系IGF-Ⅰ基因,其编码区长393bp。该编码区编码一个130个氨基酸的IGF-Ⅰ前体蛋白,分子量为14400,等电点为9.144,是一个偏碱性蛋白。

2.研究发现

(1)WZSP近交系血清GH浓度略低于大白猪,但二者之间差异不显著(P>0.05);品种内公母之间差异不显著(P>0.05);而WZSP近交系血清IGF-Ⅰ浓度明显低于大白猪,达到显著水平(P<0.05),其中WZSP近交系母猪血清IGF-Ⅰ水平显著低于大白猪母猪(P<0.05)。

(2)尽管WZSP近交系GH9号位置发生氨基酸替换,缬氨酸替换丙氨酸(A→V),22号位置 WZSP近交系发生氨基酸替换,谷氨酰胺替换精氨酸(R→Q)。但这两处氨基酸替换均位于信号肽编码区,对GH的成熟肽没有影响。

(3)WZSP近交系GHR基因胞内结构域存在5处氨基酸替换,可能会影响到WZSP近交系GHR下游的信号转导;而比对大白猪的GHR基因编码区推导蛋白氨基酸序列与WZSP近交系GHR发现: GHR胞外结构域和胞内结构域均存在2处氨基酸替换,其中165号位置的氨基酸替换位于GHR的 FN3保守结构域中,推测该氨基酸替换可能对GHR的结构和功能产生重要的影响。其结构与功能性变化类似侏儒人和侏儒鼠。

(4)WZSP近交系IGF-Ⅰ基因编码区393bp。该编码区仅发现一个同义突变,未引起所编码氨基酸的变化。

(5)构建了WZSP近交系GH和GHR基因原核表达载体,并进行诱导表达,WZSP近交系GH基因得到正确表达,在目的分子量处出现特异性条带,经软件扫描,其含量约占菌液总蛋白的20%; WZSP近交系GHR基因并没有发现特异性条带,推测可能是由于大肠杆菌的密码子偏爱造成了该基因在原核生物中表达困难。

(6)构建了WZSP近交系GH基因、大白猪和WZSP近交系GHR基因真核表达载体,并转染猪肾细胞PK-15进行表达,采用相对定量RT-PCR方法检测JAKZ基因表达,结果发现:转染大白猪 GHR基因的细胞JAK2基因表达水平显著高于转染其他三种质粒的细胞(P<0.05),转染WZSP近交系GHR基因的细胞JAK2基因的表达水平最低,推测WZSP近交系GHR基因所发现的氨基酸替换可能会影响其下游JAK2基因的表达,从而会影响GH的促生长作用。

3.待研究的工作内容

(1)对于WZSP近交系GH基因的原核表达产物,还需作进一步的实验研究,如通过Ni-NTA Agarose柱对表达产物进行纯化并制备抗体,然后进行酶联免疫吸附测定、蛋白质印迹分析和免疫组织化学方法的检测。

(2)进行G418筛选浓度的优化筛选稳定转染WZSP近交系GHR基因的真核表达细胞,并对细胞水平的蛋白质合成、脂生成和JAK2的磷酸化进行检测,进一步证实该基因的作用。

(3)运用定点突变的方法获得一系列WZSP近交系GHR的突变体基因,并构建成表达质粒。转染细胞并获得表达后,研究GHR及其突变体的生物活性。

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