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实验攻略

《自然》子刊:颠覆认知!科学家揭示CRISPR/Cas9切口全新连接机制,未来有望实现精准连接

2018年08月24日 浏览量: 评论(0) 来源:生物谷 作者:生物谷 责任编辑:admin
摘要:近日,加州大学伯克利分校的Jacob Corn团队在Cas9切割后的修复机制上也取得了颠覆认知的重大突破。
从2013年张锋[1]和George Church[2]第一次使用CRISPR-Cas9编辑人体细胞算起,这项技术在人体细胞中的使用已经走过5个年头。
 
虽然CRISPR被科学家使用的很溜,并已经走到临床试验阶段;但我们对Cas9的切割原理和切割后细胞修复机制的了解还比较少,甚至可以说它们还是个黑盒子。
 
前不久,上海交通大学吴强教授课题组在Molecular Cell上发表了一篇文章,他们发现Cas9切割DNA双链可以产生突出末端,而不仅仅是平头末端,这颠覆了我们对Cas9切割的认知[3]。
 
近日,加州大学伯克利分校的Jacob Corn团队在Cas9切割后的修复机制上也取得了颠覆认知的重大突破。
 
总的来说,Corn团队这次解决了一个长期困扰科学家的问题:用CRISPR-Cas9切断细胞的DNA之后,细胞究竟是如何选择用哪种方式修补断裂的缺口的?
 
更重要的是,他们的这个发现甚至可以让科学家以后根据自己的需求,操纵细胞的修复方式,让细胞基因组DNA在被Cas9切断后,按照需求去修复缺口。正真实现精准切割,精准修补。
 
这对很多需要做基因修复的遗传疾病而言,无疑是个好消息。上周四,Corn团队的这一重要研究成果发表在《自然遗传学》上[4]。
 
CRISPR-Cas9只是上帝的手术刀,修复还是得靠细胞
 
一直以来,我们都形象地把CRISPR-Cas9叫做“上帝的手术刀”,而不把它叫做“上帝的针线包”,主要是因为Cas9只负责精准的切断DNA,修复的任务要交给细胞自身。
 
通常情况下,CRISPR-Cas9切断DNA形成的双链断裂后,细胞会很快启动紧急修复机制。其中最主要的两条是:非同源末端连接和同源重组。
 
其中非同源末端连接修复机制被科学家用的最多,效率也最高。它就是不管三七二十一,尽快把断裂的DNA连接起来,维持DNA的稳定。这种修复方式绝大部分情况下会在切割位点产生随机插入或缺失,直接导致基因功能丧失。
 
无论如何,对细胞而言,损失一个基因,比挂了肯定好多了。这种修复方式其实也是细胞的最常见修复方式。鉴于这种修复方式的特点,它被广泛用于基因功能的研究。
 
而同源重组修复机制,则是在有同源供体DNA序列的配合下,用一段正确的基因序列替换原本错误的基因序列[5]。也就是我们常说的:哪里坏了,换哪里。科学家和医生治疗基因变异导致的疾病,依赖的就是这种修复方式[6]。
 
目前,同源重组修复过程中使用的外源DNA模版有两种:一种是双链DNA,另一种是单链DNA模版修复(SSTR)。
 
不过,大量的研究表明,把双链DNA作为模版修复断裂的DNA在绝大多数细胞类型中是非常低效的[7]。相较而言呢,以单链DNA为修复模版的SSTR模式在人类细胞中倒是很高效[8],所以使用的也比较多。
 
虽然SSTR效率高,但是Corn团队在不同的人类癌细胞系中做研究还是发现,SSTR的修复效率还是有很大的差异,从完全无效的0%,到非常高效的30%。这似乎暗示,SSTR是否能完成修复与细胞类型有一定的关联。
 
再仔细一想呢,不同细胞类型的基因表达水平实际上是相差很大的,是不是某些特殊的DNA修复通路的打开或关闭,影响了SSTR修复的效率呢?
 
如果我们能发现影响SSTR修复机制的相关基因,那么在以后的临床应用中,在编辑基因的同时,特异性的调节相关基因的表达水平。那转化效率就可以大幅提升,治疗效果也会稳步提升啊。
 
研究人员赶紧去查查相关资料。
 
很幸运,SSTR在人体中修复的机制还鲜为人知。如果能解决这个困扰着很多科学家的问题,那么Corn团队肯定很开心。
 
此处应该再次出现斯托帕德那句话:“再一次一无所知,从头开始……这让我很开心。”
 
聪明的实验设计
 
Corn团队的研究人员究竟有多开心我是没办法知道了。不过,当我看到他们解决问题的思路时,我何止是很开心,简直是很兴奋,以至于喝了5杯浓茶也没驱散的午间睡意,瞬间消散。
 
他们首先做了一个假设:既然是DNA断裂的修复出现了不稳定的问题,那问题应该就处在细胞内跟DNA修复有关的基因上;如果在调控那些修复基因表达的同时,同步开展CRISPR-Cas9的剪切,和切断后的SSTR修复,不就可以通过二者之间的相互作用找到影响SSTR的关键基因了吗!
 
于是,研究人员首先找到了2000多个跟DNA修复有关的基因。然后做了一个非常聪敏的设计。
 
他们创造性的使用了CRISPRi基因沉默技术[9]、CRISPR-Cas9基因编辑技术和荧光标记技术,创建了一个可视化的“沉默-编辑”平台。
 
首先,他们给所有的细胞加了个蓝色荧光基因,让这些细胞发蓝光。
 
所有的细胞都蓝莹莹的,真好看~
 
然后,给这些细胞分别装入用来沉默修复相关基因的CRISPRi基因沉默系统。每个细胞沉默掉一个修复相关基因,在一个有数百万个细胞的群体中,就产生了2000个基因分别被沉默掉的细胞库。
 
紧接着,研究人员就要对那个蓝色荧光蛋白基因下手了。
 
他们把靶向切割蓝色荧光蛋白基因的CRISPR-Cas9编辑系统,以及一个与蓝色荧光蛋白基因有同源臂的绿色荧光蛋白基因的单链DNA,一起转到上面的那个细胞库里。
 
接下里会发生什么,你们肯定能想到把,还需要我说吗~
 
忍不住了,我还是说下吧。
 
理想状况下(我们只说理想状况下),上面的细胞库颜色会发生如下变化。有些还是蓝色,意味着基因编辑失败;有一些细胞没有颜色了,大概率意味着意味着Cas9把蓝色荧光蛋白基因切断了,然后细胞按照非同源末端连接的方式又把它随便连上了,导致基因功能丧失了;剩下的细胞成功变绿了,这些细胞实现了SSTR修复。
 
研究人员用流式细胞仪按照颜色,给所有的细胞分分成三拨:有6.8%的细胞还保持这蓝色,有67.5%的细胞不显色了,22.8%的细胞变成了绿色。
 
加起来是97.1%,还有2.9%的细胞怎么了?这些细胞出现了理想状况之外的情况,我们就不管它们了。
 
未被重视的“交通信号灯”
 
有了上面的细胞。接下来的事情就好办了,用二代测序技术,分析分析这三个细胞群体中gRNA的水平变化,就可以知道哪些基因会影响SSTR的效率了。
 
这一分析不要紧,研究人员发现之前认为与SSTR修复有关的DNA修复基因,似乎与SSTR关系并不大。
 
让研究人员意外的是,那些处在范科尼贫血(Fanconi anemia;FA)的通路上的基因,与SSTR关系密切。
 
范科尼贫血是瑞士儿科医生Guido Fanconi在1927年首次报道的,它是一种罕见的常染色体隐性遗传性血液系统疾病[10]。1992年报道了4个可能与FA相关的基因,到现在已经鉴定出了20多个与FA的发病有关的基因变异。
 
FA通路涉及超多蛋白
 
一直以来,研究人员认为,FA通路上的基因编码的蛋白与识别和修复基因组中的链间交联(ICL)有关。并不认为它与CRISPR-Cas9导致的DNA双链断裂修复有关。
 
这个发现,被研究人员视为至宝。
 
为了进一步证实FADNA修复通路上的蛋白与SSTR修复模式效率之间的关系。研究人员用CRISPRi分别稳定地敲低了FA路径中的FANCA,FANCD2,FANCE,FANCF,FANCL,HELQ,UBE2T,USP1和WDR48。发现SSTR修复模式效率显着下降。
 
如果在敲低的同时,用cDNA在细胞内稳定地表达那个敲低的蛋白,让它们的表达恢复到野生的水平。研究人员发现,SSTR修复模式效率提升8倍,回升到正常水平。
 
这些研究表明,FA通路中的许多基因对SSTR修复模式是必需的。
 
更有意思的是,研究人员还发现FA通路只影响SSTR,它不会促进非同源末端连接。总体来说,在DNA被切断之后,细胞修复DNA的首选方式是非同源末端连接,这也是为什么这种修复方式一直比例最高。
 
FA通路就是个红绿灯
 
而FA通路更像个“交通信号灯”:在FA通路不活跃的时候,所有的车都朝一个方向(非同源末端连接)开;但如果FA通路很活跃,那么它就要指挥其中一部分车往另一个方向(SSTR)走。
 
原来是这样!
 
用论文第一作者Chris Richardson的话说,就是“FA通路是维持非同源末端连接和SSTR之间平衡的”。
 
后记
 
“治疗镰状细胞贫血,成功的机会与用正确的基因替代突变的基因效率密不可分,”Richardson这么评价自己的研究[11],“如果你从患者那里获得了100万个细胞,30%-40%的替换率肯定比10%的好多了。”
 
现在看来,Richardson的愿望真的有可能实现了。
 
将来,科学家可以通过分析细胞基因的表达水平,提前预知一类细胞是否适合SSTR。如果这类细胞SSTR效率低,甚至可以考虑临时激活FA通路。
 
无论如何,科学家掌握了Cas9切割后的这层修复机制,未来给患者换个基因啥的,那简直是效率高多了。
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