RSS订阅

业界动态

您现在的位置:首页>行业新闻>业界动态

非人灵长类模式动物--写在《实验动物管理条例》发布实施三十周年系列篇之十六

2018年10月24日 浏览量: 评论(0) 来源:国家实验动物专家委员会简报 2018年第36期 作者:中国科学院上海生命科学研究院神经科学研究所 孙强 责任编辑:admin
摘要:非人灵长类动物为社群性动物,具有明显的社会等级关系和复杂的行为活动,相对于常用的啮齿类实验动物,非人灵长类在生理、解剖、行为和生物医学特性上更接近于人类,是医学和生命科学研究中的高级实验动物,在人类疾病防控的疫苗研制研发、人类脑功能与神经系统疾病研究中具有其他实验动物难以替代的作用。随着对人类医药和健康研究的深入,低等模式动物在一些领域已经不能满足研究的需要,迫切需要建立诸如猴等进化上与人类更接近的动物模型。
编者:资源增量是实验动物科技发展的核心任务,是实验动物对生命科学研究提供支撑和服务的基础和保障。自上世纪80年代以来,我国老一辈实验动物科学家苦心孤诣,在实验动物资源研发工作中取得了多项开创新成果。
 
1988年《实验动物管理条例》发布实施,在实验动物工作规范化、法制化管理,保障实验动物和动物实验的质量,推动我国科技发展和民生保障等方面发挥了重要作用。特别是在实验动物资源标准化、新品种/品系开发和动物模型创制方面,取得了令人瞩目的成果。
 
为此,借“科技资讯”之窗,陆续推出我国实验动物专家在此领域所作的工作及取得的应用成果。
 
非人灵长类模式动物
 
非人灵长类动物为社群性动物,具有明显的社会等级关系和复杂的行为活动,相对于常用的啮齿类实验动物,非人灵长类在生理、解剖、行为和生物医学特性上更接近于人类,是医学和生命科学研究中的高级实验动物,在人类疾病防控的疫苗研制研发、人类脑功能与神经系统疾病研究中具有其他实验动物难以替代的作用。随着对人类医药和健康研究的深入,低等模式动物在一些领域已经不能满足研究的需要,迫切需要建立诸如猴等进化上与人类更接近的动物模型。 
 
一、非人灵长类模式动物构建技术发展简史和面临的问题
 
哺乳动物转基因技术依赖于辅助生殖和胚胎操作。小鼠上早在上个世纪80年代就已经建立基因原核注射的过表达转基因技术和基于胚胎干细胞的基因敲出和敲入技术。这不仅仅是因为小鼠是最常用的实验动物,早在上个世纪初就培养了大量遗传背景一致的近交系,还因为小鼠具有多胎生殖、性成熟和繁殖周期短等天然优势。而最为广泛使用的非人灵长类实验动物食蟹猴和恒河猴不仅遗传背景复杂,且为有月经周期的单胎生殖,即每个月经周期排卵1-2枚,而其性成熟时间更是长达4年以上,加上近半年的怀孕期(约160-170天),这样整个繁殖周期要在5年以上,同时,目前也没有得到可生殖系传代的胚胎干细胞。在胚胎资源有限和低繁殖能力这一天然劣势的限制下,非人灵长类模式动物构建技术进展相对缓慢。2001年,美国俄勒冈健康科学大学的Schatten教授团队利用高滴度的逆转录病毒载体成功将外源基因导入恒河猴的胚胎,获得了世界上首只转基因灵长类动物ANDi(意指inserted DNA),虽然在其得到的3只出生个体中仅有1只检测到了外源基因GFP的整合和嵌合表达,但这一开创性的工作标志着转基因非人灵长类技术的诞生。同年7月,Wolfgang 等同样利用慢病毒载体转染恒河猴囊胚期胚胎后移植,也得到了在胎盘组织中整合了外源eGFP的转基因恒河猴。这两个开创性的工作说明转基因非人灵长类技术实现了从理想到现实的转变。他们都选择绿色荧光蛋白作为转入的目标基因,其主要目的还是用来探讨转基因非人灵长类技术的可行性。在这些工作发表7年后,美国佐治亚州亚特兰大埃默里大学Anthony Chan团队于2008年报道利用慢病毒转染技术得到了世界上首批亨延顿舞蹈症转基因恒河猴。亨廷顿疾病是一种显性的神经性病变疾病,主要是因为人亨廷顿基因 (HTT) 第一个外显子中CAG重复扩增,导致表达的亨廷顿蛋白中含有多聚谷氨酰胺,从而引发运动机能损伤、认知功能退化和精神失调等一系列病症,患者发病10−15年后就会死亡。虽然也有亨廷顿疾病啮齿类转基因动物模型,但这些模型都不能很好地模拟亨廷顿疾病在人体的表型特征。在亨廷顿转基因恒河猴的工作中,作者把人HTT基因的第 一个外显子上后面链接84个CAG重复序列,并把这段重组序列包装到慢病毒载体中,得到高滴度的慢病毒颗 粒 (滴度>109PFU/mL)。通过卵母细胞透明带下注射把病毒粒子注射到恒河猴MI期卵母细胞的卵周隙。之后,再通过单精注射让卵母细胞受精和胚胎移植,成功得到转基因恒河猴。分析结果显示转基因猴不仅表达了外源基因, 而且出现了神经纤维网聚集、核内含物,同时,表现出肌无力和舞蹈症等亨廷顿舞蹈症病人的典型标志表型。作为第一个非人灵长类疾病动物模型,亨廷顿疾病转基因恒河猴模型的意义之大是不言而喻的。该模型可以让人们更好、更深入地了解亨廷顿疾病,研究其发病机制和致病机理,从而研发出相对应的治疗方案和药物。同时,该模型的建立也证明了构建其他非人灵长类疾病模型的可行性。其后,2009年日本科学家Sasaki等利用绒猴性成熟时间相对较短的特性,通过慢病毒载体转染技术成功得到了可生殖系传递的GFP转基因绒猴。我国虽然在非人灵长类辅助生殖和转基因技术上起步较晚,2008 年华东师范大学报道了国内首例试管食蟹,这足足比美国晚了24年(第一只试管猴出生于1983年),但经过近10年的发展已经逐渐赶上并超过了美国、日本等国,处于领跑地位。
 
在过表达转基因猴构建工作上,2010 年中国科学院昆明动物研究所报道了国内首例转基因猴;2016年中科院神经科学研究所非人灵长类研究平台孙强团队与仇子龙组报道了用慢病毒转染方法将人的自闭症相关致病基因MeCP2成功转入食蟹猴个体得到了多只有类似人类自闭症表型的转基因食蟹猴,并利用灵长类研究平台首创的猴精巢异种移植技术提早得到了转基因猴的F1代。通过慢病毒载体介导得到的非人灵长类转基因技术只能完成外源基因的过表达操作,致其应用范围有限。由于在非人灵长类上还未建立可生殖系整合的猴胚胎干细胞系,因此还不能像通过胚胎干细胞基因打靶操作获得基因敲除小鼠模型那样来构建基因敲除猴模型。随着人工核酸酶技术的出现,尤其是高效的CRISPR-Cas9核酶的出现,使得我们可以跨过非人灵长类无胚胎干细胞用于进行同源重组基因打靶的这一技术障碍,直接通过早期猴胚胎注射用于靶向特定基因的分子核酶对靶基因进行编辑,进而获得相应靶基因突变的猴模型,这使得非人灵长类基因编辑成为了可能。
 
2014年,来自昆明理工大学和中国科学院神经科学研究所的两个团队分别通过受精卵注射靶向食蟹猴Mecp2基因的TALEN质粒和mRNA得到了Mecp2 基因突变食蟹猴。 随后南京大学、南京医科大学和昆明理工大学联合报道了使用CRISPR/Cas9技术获得了基因编辑的食蟹猴。该工作通过将针对Ppar-γ、Rag1 和Nr0b1三个基因的5条sgRNA和Cas9 mRNA混合注入食蟹猴受精卵的卵胞质并将注射后的胚胎移植到代孕受体,最后得到了Ppar-γ 和 Rag1基因编辑食蟹猴。之后,来自中国的多个实验室报道了多种不同的基因编辑猴,而日本科学家利用ZFN和TALEN成功获得了IL2RG基因编辑绒猴。至此,过表达和基因编辑这两项主要的模式动物构建技术在非人灵长类的主要物种恒河猴、食蟹猴和绒猴上都获得了成功。
 
二、如何实现非人灵长类模式动物构建的标准化
 
然而,慢病毒载体介导外源转基因通常是以多位点多拷贝整合的方式整合到宿主基因组中,而通过基因编辑技术构建的首建猴个体多数为嵌合体突变,这导致我们很难得到基因型一致的转基因或基因编辑首建个体。而这种基因型的多变,也使得我们很难精确地将转基因或目的基因突变和潜在表型对应起来。因此,利用这些方法得到的首建猴并不能称之为标准的动物模型。
 
为了有效解决这一问题,建立基于体细胞核移植的非人灵长类模式动物构建技术成为了必然。这是因为在核移植前,可对体细胞进行转基因或(和)基因编辑操作以得到含有目的基因修饰的细胞,在将基因修饰后的细胞作为供体核进行核移植,就可得到一批遗传背景一致的基因修饰克隆动物。然而,这一技术建立的前提是首先攻克非人灵长类的体细胞核移植技术,并得到健康的克隆猴个体。
 
自1996年,首个体细胞核移植哺乳动物多莉羊出生以来,利用该技术已经得到了包括马、牛、羊、猪和骆驼等在内大型家畜,也得到了包括小鼠、大鼠、兔、猫和狗在内的多种实验动物。非人灵长类体细胞核移植的研究工作从2002年就开始有报道,尽管有国内外多家机构不断尝试,但是这些研究最终都没有成功得到体细胞核移植来源的克隆猴。2003年,美国匹兹堡医学院Schatten教授操作了700枚猴卵,并移植16只受体,没能得到一只怀孕受体。2007年美国俄勒冈国家灵长类研究中心教授Mitalipov接受采访时指出,他前后共利用了15000枚卵母细胞用于克隆猴实验,但得到的最好结果也仅仅是怀孕81天后的流产组织。国内外多家顶级实验室在此领域连续受挫,使得科学家们逐渐失去了对该领域继续攻关的信心。之前的体细胞克隆猴研究之所以一直没有获得成功,主要有两方面的原因。一是非人灵长类体细胞核移植技术要求高,无论是卵母细胞去核还是体细胞的注入,灵长类核移植技术操作难度远高于目前已经成功的其他哺乳动物。二是,克隆胚胎发育效率低,灵长类体细胞克隆胚胎的发育效率远远低于其他哺乳动物。
 
为了建立非人灵长类体细胞核移植技术并得到健康存活的克隆猴,中科院神经科学研究所非人灵长类研究(苏州)平台孙强团队经过多年积累,熟练的掌握并改进了猴体细胞核移植的一系列显微操作技巧,同时针对多种能够提升哺乳动物体细胞核移植效率的方法,进行了逐一验证并筛选得到了可以明显提升猴体细胞核移植胚胎发育效率的方法,在联合使用组蛋白(H3K9me3)去甲基化酶Kdm4d和去乙酰化酶抑制剂TSA的条件下,成功将食蟹猴体细胞克隆胚胎的体外囊胚发育率从13.8%提升到了44.7%,同时囊胚的质量也有了显著的提高。在此基础上,以胎猴成纤维细胞为供体细胞,进行了克隆猴胚胎构建和移植,成功得到了世界上首批健康存活 的体细胞克隆猴“中中”和“华华”。此项技术突破为非人灵长类模式动物构建提供了重要的技术支持,被《Cell》 杂志主编Emilie Marcus称赞为“生物技术领域近20年来的里程碑事件”。
 
体细胞克隆技术的建立对于开展非人灵长类基因编辑动物模型研究至关重要。首先,在体细胞上可实现复杂的遗传操作;其次,通过严格筛选可去除脱靶;最后,可在一个孕周期(160天)内获得遗传背景和基因型都一致遗传修饰猴,这也有效克服了非人灵长类实验动物无遗传背景一致的近交系和传代时间过长的问题,使得非人灵长类遗传修饰动物称为真正意义上可以广泛应用的标准化的模式动物。
 
三、非人灵长类模式动物的应用前景
 
针对特定遗传相关疾病的转基因动物模型可以让科学家更好的理解疾病发生发展的过程和机制。如在神经退行性疾病如阿尔茨海默氏病和帕金森病的动物模型构建中,由于啮齿类动物在认知和行为上与灵长类的巨大差异,使其在病理学与行为学特征的模拟以及药物疗效评价等方面都存在着无法弥补的缺陷,这也在一定程度上延缓了神经退行性疾病的研究和药物研发进程。借助于非人灵长类动物模型来研究神经系统疾病有望在较大程度上弥补这些缺陷。在生殖与健康领域,非人灵长类中的食蟹猴和恒河猴都是有月经周期的实验动物,且其平均周期也是28天,在月经周期内的生殖相关调控激素如促卵泡素、促黄体生成素、雌二醇和孕激素等的表达时相和变化规律与人类高度相似,因此是研究生殖内分泌调控的最理想实验动物模型。此外,恒河猴和食蟹猴都有较长的青春期,也是用于研究青春期启动和调控机制的理想动物模型。
 
随着免疫疗法在肿瘤患者的治疗中产生了非常好的疗效,伴随而来的免疫因子风暴和脑水肿等副作用也成为不可回避的问题,而小鼠模型很难模拟这些病理进程,今年初在cancer discovery上的一篇报道,用恒河猴模型成功模拟了CAR-T处理后的免疫因子风暴和脑水肿症状,因此可以预见,在不就的将来非人灵长类模式动物将在这个领域也发挥重要作用。此外诸如HIV,Ebola,Zika等感染性疾病的防控及疫苗研发也离不开非人灵长类模式动物,类似糖尿病、高血压等慢性疾病,发病时间长,也同样需要有较长寿命的非人灵长类动物模型。而通过结合基因编辑和体细胞核移植技术构建的标准化的非人灵长类模式动物,必将在这些研究领域发挥重要做成,从而更好地促进人类健康事业发展。
 
参考文献
 
[1]Chan AW, Chong KY, Martinovich C, et. al. Science. 2001; 291:309–12. 
 
[2]Yang SH, Cheng PH, Heather B, et. al. Nature. 2008; 453:921–25. 
 
[3]Liu Z, Cai YJ, Sun Q. Chin J Biotech, 2017, 33(10): 1665–1673. 
 
[4]Liu Z, Li X, Zhang JT, et al.Nature, 2016, 530(7588): 98–102. 
 
[5]Niu YY, Shen B, Cui YQ, et al. Cell, 2014, 156(4): 836–843. 
 
[6]Sun Q, Dong J, Yang WT, et al. Proc Natl Acad Sci USA, 2008, 105(35): 12956–12960. 
 
[7]Sasaki E, Suemizu H, Shimada A, et al. Nature, 2009, 459(7246): 523–527. 
 
[8]Liu Z, Zhou X, Zhu Y, et al. Neurosci Bull, 2014, 30(3): 381–386. 
 
[9]Liu Z, Nie YH, Zhang CC, et al. Cell Res, 2016, 26(1): 139–142. 
 
[10]Liu Z, Cai YJ, Wang Y, et al., 2018, Cell 172, 881–887 
 
[11]Taraseviciute A, Tkachev V, Ponce R, et. al. Cancer Discov. 2018 Jun;8(6):750-763.
点击这里给我发消息 点击这里给我发消息 点击这里给我发消息