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western-blot实验经验总结

 

我做了很久的WB,最大的一个难点感觉在于样品制备上!蛋白的降解有些时候是你想象不到的,可能出奇的糟糕,也可能完全没事~~如果单独做WB的话,感觉以“快速彻底裂解,先变性后保存”的原则比较有效,尽量选择足够强的裂解液,甚至直接给loading buffer裂解,然后取出部分蛋白定量,其余加入loading buffer100度充分变性,再分装保存。有些时候比蛋白酶抑制剂更有效。

另一个感觉就是样品中目的蛋白的量,限于WB的检测下限问题,一般目的蛋白量最好别低于1ng(虽然ECL法下限是0.1ng,即100pg),最好在10ng以上为好。这就要求在做WB之前必须充分考虑目的蛋白的可能丰度,最好充分的准备工作然后再设计细胞量或者组织量,千万别把样品搞稀了,否则就不好办了。
 

还有一个就是显影液的选择。如果选择了不合适的显影液,就会造成背景高,灵敏度差,易淬灭,发光时间短等问题。建议选择合适的显影液。我用的是Enlight-plus这一款ECL发光液,超灵敏的,发光时间也挺长,最后出来的图像很清晰。

 

最后,还是多看文献,在做某个蛋白之前最好看看别人是如何做的,有什么特殊要求,内参如何选等等。

 

 

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