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模型制备

大鼠不同程度脑损伤模型

2018年11月29日 浏览量: 评论(0) 来源:《实验动物血液生理生化参考手册》 作者:王冬平、曾林、尚世臣 主编 责任编辑:yjcadmin

(1)复制方法  健康雄性大鼠,体重为230~260g。采用改进的Feeney自由落体硬膜外撞击方法。损伤装置由底板、固定支架、垂直导杆、下落击锤和聚乙烯撞击圆锥组成。撞击圆锥头端直径为4mm、高为2.5mm。经腹腔注射水合氯醛(按350~400mg/kg体重的剂量)或戊巴比妥钠(按50~60mg/kg体重的剂量)麻醉。将其头部固定于立体定向仪上,剪去顶部毛发,手术区域皮肤消毒。沿中线左侧切开头皮,分离骨膜,用牙科钻于中线旁2mm、紧挨冠状缝后开一直径5mm的圆形窗,硬膜保持完整。用20g砝码于10cm和30cm高处通过一金属导杆坠落,撞击置于硬膜上的圆锥上致轻、中型损伤,另用40g砝码于25cm高处坠落致重型损伤。轻、中、重三型损伤的致伤冲击力分别为200g·cm、600g·cm和1000g·cm,用锌汀粉封闭骨窗,缝合头皮,置鼠笼喂养。

(2)检测指标

1)脑含水量测定  动物断头处死后,30s内取出大脑,用滤纸吸尽脑表面血渍后,锐性分离左侧顶叶皮质约100mg,用电子分析天平称湿重后,置于110℃恒温干燥箱内烤干(24h),称干重。用Elliot公式计算各部位脑含水量百分率:

脑含水量(%)=[(湿重-干重)/湿重]×100%

2)血脑屏障定量测定  动物于损伤前1h注射2%伊文斯蓝(3ml/kg体重)。在取脑组织前,为清除血液中染料,可用生理盐水经左心室灌注至右心室流出清亮液体为止。取损伤侧皮质分别称重,加入二倍体积的二甲基甲酰胺,50℃水浴中孵育72h,1500g离心,离心10min,取上清液。应用分光光度计在伊文斯蓝最大吸收光谱635mm处检测吸光度,从标准曲线上查得伊文斯蓝含量,结果以μg/g脑组织表示。

3)病理学观察  损伤后24h再次麻醉,经升主动脉快速灌注生理盐水150ml,继之快速灌注冰冷的4%多聚甲醛200ml,随后再用其300ml在2h内慢速灌注,取脑组织浸入4%多聚甲醛内4℃后固定48h,常规乙醇脱水,石蜡包埋,行5μm冠状切片,作HE染色及尼氏小体染色,光镜下观察。若采用透射电镜观察者,灌注液为4%多聚甲醛和2%戊二醛/0.1MPB(pH7.4),随后浸入2%戊二醛/0.1MPB(pH7.4)内,4℃固定过夜。常规脱水,环氧树脂包埋,超薄切片,醋酸铅铀染色,透射电镜观察。

(3)模型特点

1)脑含水量变化  轻型脑损伤伤后30min,伤侧脑皮质含水量开始升高,3h显著升高,24h达高峰,为80%左右。72h含水量有所降低,至损伤后168h脑含水量恢复正常。中型脑损伤伤后15min,伤侧皮质含水量即已升高,30min显著升高,6h达高峰,也为80%左右,持续至24h。至168h含水量基本恢复正常。重型脑损伤伤后其伤侧皮质含水量于伤后15min明显升高,伤后3~6h达高峰,持续至72h。伤后168h脑含水量仍高于正常对照值。

2)血脑屏障定量测定  脑损伤后血脑屏障通透性明显增高,并随损伤程度的加重而加重。在损伤15min后,损伤侧皮质伊文斯蓝含量就明显增高,轻、中型于6h达高峰,重型者3h达高峰,24h开始下降。

3)组织学和超微结构改变

①光镜观察  轻型损伤后24h光镜观察,见神经细胞周围出现水肿,尼氏小体染色变浅,微血管外间隙扩大;中型损伤后24h,神经细胞周围水肿,微血管外间隙增大更为明显;重型损伤后24h,皮质神经细胞周围水肿明显,尼氏小体染色明显变浅,微血管内皮细胞肿胀,管腔狭窄更加明显。

②透射电镜观察  轻型损伤伤后24h,伤侧皮质神经细胞线粒体明显肿胀,内质网轻度扩张。神经细胞周围神经毡肿胀,微血管内皮细胞胞饮小泡增多、肿胀、管腔狭窄。胶质细胞出现水肿改变,特征同神经细胞,但改变较轻微;中型损伤后24h神经细胞线粒体及神经毡空泡样变,微血管内皮细胞肿胀及管腔狭窄明显;重型损伤伤后24h,绝大部分神经细胞及胶质细胞内可见到空泡样变的少数线粒体及高度扩张的内质网。细胞核染色质边聚,染色变淡,核膜皱缩。神经毡完全空泡样变。微血管内皮细胞肿胀更加明显,胞饮增多,管腔明显狭窄。

(4)比较医学  此模型为自由落体脑损伤,属机械性损伤,类似临床上的加速伤。由于损伤部位局限,所造成的局部脑损伤性质与临床上见到的脑挫裂伤相似。该模型具有以下优点:①损伤机制单一便于定性研究。②方法简单,条件易于控制,采用自由落体打击法,可根据需要控制高度和重量。③致伤程度较一致,重复性好。④脑水肿性质与临床上创伤性脑水肿相似,定量准确。⑤实验对象采用大鼠,价廉、抗病、便于大批定量研究和长时间观察。

此方法也可采用小鼠和新西兰白兔。小鼠:将小鼠固定在自由落体脑损伤装置的底部平台上,用直径约4mm的撞击锤尖端顶在小鼠颅骨矢状面左侧2~4mm处,取50g砝码,从15cm高处自由落下,通过撞击锤造成闭合性脑外伤模型动物。兔子:于头顶部正中矢状位切开至颅骨表面,分离两旁软组织,微型钻头在右顶骨上四点钻孔。线锯锯开骨桥,在右顶骨上形成直径为1.5cm×1.5cm的方形骨窗。置入打击垫于硬膜外,用800g·cm的打击能量使脑组织造成挫裂伤。还纳骨瓣,骨缝用医用EC胶封闭,缝合头皮。

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