RSS订阅

模型制备

阿尔茨海默病(Alzheimer disease, AD)

2018年12月26日 浏览量: 评论(0) 来源:《人类疾病动物模型复制方法学》 作者:周光兴 责任编辑:yjcadmin
摘要:AD是老年痴呆的主要类型(50%~70%),是脑老化过程中发生和发展的记忆衰退,认知障碍,智能下降,语言模糊,行为怪异的渐进性与退行性疾病。AD的病因有:AD相关基因突变和多型性,神经细胞钙稳态失调和自由基代谢异常,神经细胞凋亡等。

AD是老年痴呆的主要类型(50%~70%),是脑老化过程中发生和发展的记忆衰退,认知障碍,智能下降,语言模糊,行为怪异的渐进性与退行性疾病。AD的病因有:AD相关基因突变和多型性,神经细胞钙稳态失调和自由基代谢异常,神经细胞凋亡等。

由于AD的发病机制尚不清楚,给AD模型动物的研制带来了很大的困难,至今还没有一个能够准确反映AD特征的理想的动物模型。近年来许多学者致力于寻找和研究AD动物模型,对AD模型的报道有较多,大致可分为以下几类。

一、 胆碱能损伤致痴呆模型(Model of dementia induced with cholinerver impair)

现已公认,胆碱能活动参与人的记忆与认知功能。AD病程中胆碱能神经元的退化被认为是造成痴呆的重要病理因素。因此,动物模型主要是模拟其病理机制损伤胆碱能神经功能,主要包括物理损伤、化学药物损伤等模型。

1.穹隆-海马伞切断致痴呆大鼠模型(Model of hippocampal fimbria-fornix transection)

(1)复制方法  雄性大鼠,体重为250~300g。以水合氯醛(按350~400mg/kg体重的剂量)或戊巴比妥钠(按50~60mg/kg体重的剂量)经腹腔注射麻醉大鼠,剃除头顶部毛发后固定于脑立体定位仪上,手术区皮肤消毒,切开皮肤,暴露颅骨。参照大鼠脑立体定位图谱(国内多选用包新民的大鼠脑立体定向图谱),在前囟后2mm、中线外1mm处,用牙科钻凿开颅骨,切开硬脑膜,用双刃刀置于上述部位的脑表面,降刀4.5mm,外移1mm,再降刀1mm,外移1.5mm,最后上下抽动刀20次,以完全切断穹隆一海马伞。可行单侧,也可行双侧穹隆一海马伞切除。术后连续应用头孢唑啉钠(50mg/kg体重,ip)或庆大霉素(每只2万U/d,im)抗炎5d。迷宫测试显示,该模型动物的学习能力明显下降,与抗胆碱药物引起的学习行为障碍相似。

(2)模型特点与比较医学  该模型属于物理损伤模型,较好地模拟了AD前脑胆碱能系统的损害。可用于观察拟胆碱药物的药效学评价,还可观察药物对神经功能损伤的修复作用,是老年性痴呆临床前药效学研究的重要模型。该模型的不足之处是虽然具有学习记忆功能的损害,但并不出现老年斑、神经纤维缠结和淀粉样蛋白沉积等最典型的组织病理学特征,也无AD患者全身多系统功能衰老的表现。且毁损范围较大,目前已不多用。

2.注射鹅膏氨酸致痴呆模型(Model of injected ibotenic acid IBO)

(1)复制方法  雄性大鼠,体重为250~300g。以水合氯醛(按350~400mg/kg体重的剂量)或戊巴比妥钠(按50~60mg/kg体重的剂量)经腹腔注射麻醉大鼠,剃除头顶部毛发后固定于脑立体定位仪上,手术区皮肤消毒,切开皮肤,暴露颅骨。前囟后0.8mm、中线旁3mm处以牙科钻钻开颅骨,参照立体定位图谱,用微量注射器于颅骨下7.4mm(迈内特(Meynert)核)处缓慢推注IBO 5~10μg/0.5~1μl(溶解于0.5mol/L的PBS中,浓度为1%)。中线对侧对称部位同法同量注射后,缝合头皮,再次消毒切口。局部伤口缝合前,宜以庆大霉素处理防止感染(3~5滴,2.50×10000U/kg体重)。假手术组相同部位注射等量的PBS。

大鼠注射IBO后有咬前肢现象,注意保护前肢。给IBO后1~35d避暗法行为实验的潜伏期明显下降;10d后前脑皮层和海马的胆碱乙酰转移酶活性降低,M型乙酰胆碱受体结合容量下降,大脑基底核大细胞性神经团面积变小,细胞数量减少,突触数量显著减少;30d后检测到海马及丘脑组织中5-HT含量明显下降。

(2)模型特点  该模型属化学药物损伤模型,为兴奋性毒素致基底核损害所致。鹅膏氨酸是谷氨酸受体激动剂,注入基底前脑后能特异性地激动胆碱能神经元的胞体,使之过度兴奋,继而引发胞内Ca2+超载等一系列反应,造成该区域胆碱能神经元的损毁。同时可激活一氧化氮合成酶,使NO生成增多,进一步加重了神经元的损伤,最终导致动物行为迟钝、学习及记忆能力下降等拟似痴呆症状。兴奋性毒素还包括红藻酸钠、N-甲基天门冬氨酸、使君子酸等。

(3)比较医学  这种兴奋性毒素所产生的损害只能模拟AD基底前脑胆碱能缺陷,而这些动物的海马ChAT则不受影响。此模型虽然不能反映老年痴呆发生的病因,也不能产生其组织病理学特征(如老年斑和神经纤维缠结等),但能代表导致学习记忆功能减退最直接的病理基础——基底前脑胆碱能神经元的缺失,因此仍是目前老年性痴呆临床前药效学研究的主要动物模型之一。

3.东莨菪碱致胆碱能损伤拟痴呆小鼠模型(Model of cholinerver impair induced by scopolamine)

(1)复制方法  参看学习记忆实验法章节中介绍的记忆获得障碍。

(2)模型特点  由于东莨菪碱为M受体阻断剂,可阻断乙酰胆碱对M受体的激动作用,造成了学习记忆功能障碍。但是该模型不直接引起胆碱能神经缺失,也属于化学药物损伤模型,且恢复快是其局限性,可用于早期药物的筛选。

4.D-半乳糖损害模型(Model of impair by D-galactase)

(1)复制方法  实验动物可选择成年大鼠或小鼠。小鼠每日经皮下注射或腹腔注射5%D-半乳糖生理盐水溶液0.5ml,连续注射40d,大鼠皮下注射10%D-半乳糖50mg/(kg·d),连续6~7周,可造成拟痴呆模型。

(2)模型特点  D-半乳糖是机体的正常营养成分。当半乳糖过多时可由半乳糖氧化酶催化生成醛糖和过氧化氢,产生超氧阴离子自由基。过量的超氧自由基可引起神经元细胞的损伤,使大脑皮层和海马神经元中的mRNA表达水平明显下降,脑内总RNA和蛋白质含量下降,脑内神经元密度降低,从而造成动物学习记忆能力的下降及机体的衰老,并引起全身代谢紊乱,产生各器官功能衰退。

(3)比较医学  D-半乳糖损害模型是由我国学者于1991年首先提出的,在国内广泛应用于抗衰老的研究,属化学物质损伤模型。它可以模拟AD的氧化损伤,使小鼠的学习记忆下降、脑内胆碱能神经功能衰退、神经递质代谢异常、皮层和海马神经元损伤。细胞超微结构显示神经元中细胞器减少、线粒体膨胀呈空泡样变形、粗面内质网脱颗粒、蛋白质合成减少等与AD类似的改变。这与机体衰老所造成的脑老化相符合。但此模型对AD缺乏针对性,目前国外很少使用。

二、 老化致痴呆模型(Model of dementia induced with ageing)

AD与正常衰老有一定关系,且老龄动物的某些表现与老年人有相似之处,由此产生了以老年动物代替动物模型。形态学观察表明,老年大鼠的隔区、斜角带核及迈内特(Meynert)基底核中的神经元萎缩、缺失,同时出现感觉、运动及学习记忆等多种功能降低,并且这一系列变化均与老年大鼠的胆碱能活动降低有关。

1.自然衰老动物(natural senescence animals)

(1)实验方法  实验动物为大白鼠,雌雄皆可,24月龄以上。行为检验工具为Morris水迷宫分析系统,进行定位航行实验和空间探索试验。也可采用穿梭箱法检验动物的记忆功能。

(2)模型特点与比较医学  需选3~6月龄的青年鼠为正常对照鼠。该模型是较为接近AD实际病理改变的动物模型,在此基础上观察老年性痴呆治疗药物能较好地反映药物的作用机制和效果。其不足之处在于:①由于AD是一种不同于正常衰老的进行性神经功能衰退性疾病,故老年动物有其局限性,它只是部分模拟了与人正常衰老相关的神经生化改变,脑内极少形成神经纤维缠结及淀粉样蛋白沉淀等 AD所特有的典型组织病理学特征,因此不能全面模拟AD的变化。②有实验材料较难得、需长时间饲养、死亡率高、实验周期长等缺点,大大限制了该模型的应用。③老年动物健康状况的差异,以及在药物吸收、代谢和分布上的变异性,有时会产生统计学意义不确定的结果。

2.快速老化小鼠(senescence accelerated mouse, SAM)

(1)模型介绍  快速老化小鼠分为快速老化亚系(senescence accelerated mouse/prone,SAM-P)及抗快速老化亚系(senescence accelerated mouse/resistance,SAM- R),是由日本京都大学首次培育成功,经20多代交配近繁,获得了遗传性与病理表型一致,符合近交系标准的新系列。 SAM-P已有12个品系,其中有两个亚品系P8和P10除具有P品系的一般老化症状外,还伴随着快速老化出现的学习记忆力障碍和低恐怖和低紧张状态,为脑老化痴呆模型小鼠。两亚系的共同点是都具有认知障碍。在青春期出现脱毛、被毛粗杂、活动低下、白内障、角膜混浊、骨质疏松等老化现象。且在渡过生长期后,伴快速老化自然发生,小鼠脑内β-淀粉样蛋白的前体蛋白(APP)mRNA的表达明显增加,可出现类似老年斑的异常颗粒聚积。

(2)模型特点

SAM-P8系:SAM—P8主要以学习记忆功能呈增龄性加速衰退,中枢神经系统如皮层、海马等部位发生病理学改变为主。在增龄过程中脑内有大量Aβ沉淀,大脑皮层和海马部位Ach,NA,DA降低以及阿片肽、GABA升高,5-HT表现为先升高后降低。葡萄糖代谢障碍,免疫功能异常(表现为NK细胞活性降低、反应性小胶质细胞介导的自身免疫机能紊乱),下丘脑一垂体前叶-肾上腺轴及性腺轴亢进。氧化应激反应则发生在大脑皮层出现病理学改变之前,表现为脂质过氧化物、过氧化氢、蛋白质羰基含量等明显升高。

SAM-P10系:SAM-P10是惟一发生与衰老相关脑萎缩的啮齿类动物,可出现自发性且发展迅速的广泛性脑萎缩,具有可遗传性特征。最易受累部位是大脑新皮层前部、后部、梨状皮层、嗅核、杏仁体、豆状核尾部、中隔、小脑皮层等,海马、脑干、间脑不易发生。SAM-P10鼠在尾悬挂和游泳实验中呈现明显的抑郁现象,研究表明,这与增龄过程中海马β-APP mRNA表达水平及谷氨酸、甘氨酸含量升高,基底前脑NGF水平降低及神经鞘磷脂酶活升高有关。

(3)比较医学  SAM-P8的病理改变及一些神经递质、激素和酶的变化等与人类的AD很相似,它既有学习记忆功能障碍等衰老的特征,又有淀粉样蛋白沉积、老年斑及免疫功能紊乱等AD的一些重要特征。尤其是其学习记忆功能障碍及昼夜节律紊乱体现了与人类AD相吻合的特点。因此,SAM-P8是良好的研究衰老与学习记忆功能及学习记忆功能障碍发生机制和评价益智药物的动物模型,并且是研究神经内分泌免疫调节网络平衡的良好模型。SAM-P10的特点是引起广泛的脑萎缩,除海马部位外,SAM-P10易萎缩部位与AD患者相一致。从而造成由脑萎缩所致的学习记忆及情感障碍,这与人类老年性疾病的病理改变相似。因此,SAM-P10不仅是研究与衰老相关神经元丢失及脑萎缩发生机制的有益动物模型,而且还是研究与衰老相关的抑郁症发生机制的良好动物模型。这两个亚系是比较理想的研究脑老化和痴呆的模型,与临床痴呆的渐进性发生极为相似。其中以P8较多用,但来源比较困难。

三、  Aβ注射致痴呆模型(Model of injecting Aβ)

该模型是利用Aβ是AD患者脑中老年斑(SP)的核心蛋白,在AD的发病中起着重要的作用而制作的。

(1)复制方法

1)SD大鼠,雌雄皆可,体重为200~300g。将戊巴比妥钠(按50~60mg/kg体重的剂量)或水合氯醛(按350~400mg/kg体重的剂量)经腹腔注射麻醉,剃除头顶部毛发后固定于脑立体定位仪上,手术区皮肤消毒,切开皮肤,暴露颅骨。以前囟定位,旁开2.6mm,后3.0mm,向下3.0mm,用牙钻在颅骨上对称打两个孔,即为海马区注射点。然后用针挑破硬脑膜,微量注射器于双侧海马内各注射5μl(10μg,溶于无菌生理盐水)Aβ1~40(或Aβ25~35),在5~10min注射完,并留针5~10min。用牙托粉填补针孔,缝合皮肤并消毒。局部伤口缝合前,宜以庆大霉素处理防止感染(3~5滴,2.50×10000μl/kg体重)。24h后便可开始分组给药。行为检验工具为Morris水迷宫分析系统,进行定位航行实验和空间探索试验。

Aβ也可以直接注入脑室,定位为前囟前:-0.9mm,中线旁开:1.4mm处钻孔,微量注射器自脑表面垂直进针3.9mm。Aβ可经侧脑室弥漫致全脑,更接近于Aβ引起细胞毒作用的实际过程。手术后需单笼饲养至大鼠完全清醒。

2)ICR小鼠,雄性,体重为18~20g。经乙醚麻醉后,实验者左手固定小鼠头部,75%乙醇局部消毒,单侧第三脑室定位(前囟前2.0mm,中缝旁开2.0mm,硬膜下4.0mm),用微量注射器缓慢注入3μl Aβ1~40(1μg/μl)溶液,注射时间为30s,留针30s,缓慢起针。7d后进行行为学测试,2周内取脑检测。

(2)模型特点  Aβ具有神经营养和神经毒性的双重作用,对一些未成熟的神经细胞具有营养作用,而对那些已分化发育成熟的神经元则起毒性作用。Aβ可诱导活性氧自由基(ROS)的产生,细胞内钙超载,加速τ蛋白磷酸化,继发炎症反应,导致神经元凋亡,引起突触功能障碍,影响信号通路等。脑内急性注射Aβ可使动物产生与AD相似的行为障碍和记忆缺损症状,主动和被动回避反射及空间分辨力下降,皮质和海马神经元减少、退变,皮质下血管淀粉样变,并出现 Aβ沉淀。

(3)比较医学  将Aβ注入动物海马区,较好地反映了 AD的特征性改变,即Aβ在AD发病中的作用。Aβ直接注入脑室后,则可经侧脑室弥漫至全脑并发挥细胞毒性作用,更接近Aβ细胞毒作用的实际过程。脑室注射具有定位准确、取材量多等优点,但造模时间较长,方法复杂,Ap用量多,造价高是其不足。小鼠模型造模简单,造价低,但取材量少,可根据实际情况和需要选择。Aβ脑内注射模型可用于研究治疗AD药物在Aβ的聚集或沉淀、神经毒性作用和小胶质细胞的炎性反应等方面的作用,是临床前药效学评价的重要模型。

四、 转基因动物模型(Model animal of genetical transfer)

转基因动物是以遗传基因学说为基础的,可以在活体上研究某一特定致病基因的作用,是研究AD的独特而重要的模型。基于遗传背景、繁殖能力、操作难度和经济角度的考虑,目前的转基因动物多选用小鼠。现有多种转基因小鼠可表达与AD病变有关的基因如β-淀粉样前体蛋白(APP)、 APP的C末端片段、τ蛋白、早老素-1(PS-1)和2、载脂蛋白E(ApoE)。转基因动物的最大优点是模拟了AD样神经病理学的特征,包括细胞外Aβ沉积、营养障碍导致的老年斑(SP)、胶质细胞增生。

转基因模型是国际承认的主要AD动物模型,但是此种模型大部分只是移植了一到两个基因,与真正的一组基因控制的动物模型还有一定的差距,而且该模型动物价格较昂贵。现简述如下。

(1)复制方法

1)APP转基因模型  以血小板源性生长因子为引物,与人类带有Val717Phe突变的APP基因片断结合成 PDAPP基因,以微注射导入小鼠受精卵中,移植到假孕雌鼠输卵管内,产生携带此突变基因的幼鼠即为转基因鼠,能够高水平表达APP。

2)PS1转基因模型  已知PS1基因突变与AD的早期发病有关,用血小板生长因子β2增强子引导神经元的表达,制作出伴有M146L或M146V的PS1基因突变转基因模型。

3)apoE转基因模型  已知apoE能够与神经细胞外可溶性Aβ高亲和力结合促进淀粉样斑块形成,调节τ蛋白磷酸化过程,促进细胞骨架瓦解和NFT形成。一些研究者采用基因组apoE的不同等位基因,通过动物自身启动子和3'增强子,将突变的apoE4基因通过上述方法转录到小鼠体内构建完成apoE4转基因鼠模型。

4)双重转基因模型  即用APP和PS1两种突变基因制作淀粉样蛋白沉积的转基因模型。

(2)模型特点

1)APP转基因模型  运用弥散张量成像(Diffusion Tensor Magnetic Resonance Imaging, DTI)技术观测到 PDAPP鼠大脑灰质和白质均有损害,且Aβ沉积量随年龄增长而逐渐增多。研究发现,在thy-1增强子调控下,将大量表达Swedish序列突变的β-APP基因(APPsw)按上述方法转录到小鼠体内产生Tg2576小鼠。此种小鼠脑血管平滑肌细胞所表达的β-APP大约是生理水平的4倍,并包含了大量的Aβ1~40和Aβ1~42,形成细胞内Aβ免疫反应阳性颗粒。这种大量表达APP基因的转基因鼠模型(PDAPP鼠)表现为神经细胞外硫黄素S阳性的Aβ沉积,突触减少,胶质细胞增生,胆碱能神经末梢变异和大脑皮质神经元退行性改变。

2)PS1转基因模型  这种模型通过选择性增加Aβ42(43)的神经毒性和破坏细胞内Ca2+稳定性,促进神经元变性从而导致AD发病。

3)apoE转基因模型  这种模型的子代小鼠中存在大量 SPs,胆碱乙酰转移酶(choline acetyhransferase, CHAT)活性明显降低。

4)双重转基因模型  这种模型能更全面的表达出AD的特征,可模拟AD早期记忆障碍,且在Aβ沉积区记忆形成相关基因的mRNA表达减少,但缺乏NFT的形成。有研究将τ突变和APPsw突变的基因转录到小鼠中,其后代为双重转基因鼠(JNPL3),边缘叶和嗅皮质区出现NFT的病理改变。

(3)比较医学  这些转基因模型可模拟AD的年龄依赖性老年斑的形成、胶质细胞增生和突触减少等部分神经病理特征,并表现出AD临床相似的行为学障碍。转基因模型可以淀粉样蛋白变性疾病和认知功能障碍的AD病提供动物模型,主要用于研究APP过度表达与AD病理改变的关系及其分子机制,也用于试验新的治疗药物。

点击这里给我发消息 点击这里给我发消息 点击这里给我发消息