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模型制备

6-羟多巴胺致大鼠帕金森病模型(Model of PD induced by 6-hydroxydopa-mine in rats)

2019年01月02日 浏览量: 评论(0) 来源:《人类疾病动物模型复制方法学》 作者:周光兴 责任编辑:yjcadmin

(1)复制方法  健康大鼠,体重为200~250g,雌雄不拘,经反复行为检测确认其无旋转行为。以水合氯醛(350~400mg/kg体重)或戊巴比妥钠(50~60mg/kg体重)经腹腔注射麻醉,剪去头部毛发,将大鼠固定于三维脑立体定向仪上,采取颅平位。手术区域皮肤消毒,皮正中切口,暴露前囟。将6-羟多巴胺(6-OHDA)注射进入脑内黑质-纹状体的不同部位(见下述),于术后7、15、22、30及60d按0.05mg/kg体重的剂量分别皮下注射苯丙胺及阿朴吗啡进行旋转行为检测。行为学检测结束后,动物麻醉后开胸,用生理盐水100~200ml左心室冲洗,然后以4℃的4%多聚甲醛(pH=7.4,0.1mol/L PBS)300ml做灌注前固定。迅速断头取脑,将脑浸入4%多聚甲醛4℃过夜,再移入含30%蔗糖PBS中4℃过夜(脱水),直至脑组织沉入容器底部,于纹状体(前囟后0.2mm)及黑质区(前囟后5.5mm)行连续冰冻横切片,片厚30μm,每间隔5张取一片作为切片。进行神经元尼氏体染色及免疫组织化染色,作TH免疫细胞化学染色,观察大鼠黑质纹状体多巴胺细胞的损毁情况。

1)黑质致密体部MPD  于前囟后4.4m,矢状缝旁1.3mm,颅骨下8.5mm为注射点,使用微量注射器注射6- OHDA 8μg(6-OHDA溶于0.2%的抗坏血酸生理盐水中),注射速度2μg/(μl·min),注射完毕留针10min。退针速度为1mm/min,以防药液溢出。术毕大鼠连续5d肌肉注射庆大霉素以防感染,每只2万U/d。

2)黑质致密体旁部MPD  使前囟与后囟在同一平面,选择黑质致密体旁为注射点(人字缝前3.5mm,矢状缝旁2.3mm,硬膜下6.8mm),6-OHDA注射量及其他处理方式同黑质致密体部MPD。

3)纹状体区MPD  调节门齿钩与耳间线处于同一平面,以前囟、矢状缝、硬膜为标志,以下三点为注射点(AP+1.0, ML-3.0, DV-5.0, TB-0.0)、(AP-0.1, NIL-3.7, DV-5.0, T1-30.0)及(AP-1.2,ML-4.5,DV-5.0,TB-0.0),分别注入6-OHDA 7μg,注射速度及其他处理方式同黑质致密体部MPD。

4)动物行为检测  造模鼠于术后7、15、22、30及60d分别给予苯丙胺及阿朴吗啡进行旋转行为检测。苯丙胺诱导旋转行为阳性时,动物以前肢为支撑点,头尾相接,身体弯曲成环状,向损伤同侧旋转。阿朴吗啡诱导旋转行为阳性时,大白鼠且多以旋转侧前肢为支撑点向损伤对侧的原地转动。动物的旋转行为达到或超过了7次/min,持续时间达30min,作为PD症状的定量指标。一般连续4周用阿朴吗啡诱发旋转次数保持稳定,即表示损毁作用已达稳定,可供试验之用。

(2)模型特点  6-OHDA为选择性DA神经元化学损毁剂。当注射至大鼠纹状体或黑质后可被DA神经元末梢或胞体的膜转运体主动摄取到细胞内,经氧化生成神经毒物,如羟自由基和醌类物质,造成线粒体呼吸链NADH脱氢酶、细胞色素C氧化酶的阻滞,使DA神经元变性、死亡,黑质一纹状体DA系统功能减退而产生类似于PD的症状。一般注射后24h出现DA能神经元变性,2~3d后出现纹状体 DA含量减少,成功的模型DA含量减少80%~90%。行为方面表现为身体向损毁侧偏斜。

单侧损毁后,通过外周给予促DA制剂可使动物产生旋转行为。DA受体激动剂(如阿朴吗啡、溴隐亭等)可引起动物向健侧旋转,这是因为损毁侧黑质一纹状体DA系统破坏后,突触后膜的DA受体因失神经支配而敏感性增高,此时应用DA受体激动剂使损伤侧兴奋作用占优势而产生向健侧旋转。与此相反,若给予促DA释放制剂(如苯丙胺)则使动物向损毁侧旋转,因为损毁侧神经末梢可供释放的DA含量远低于健侧,因而健侧DA效应占优势。通过记录一定时间内药物诱发的旋转次数,可对PD症状的严重程度进行量化。此外,根据药物诱发的旋转方向,可以判断药物是通过突触前机制(即促释放)或突触后机制使DA受体兴奋,即区分是间接还是直接的DA受体激动剂。

(3)比较医学  6-OHDA单侧损毁制备的旋转模型是目前用得最多的PD模型之一,在数周内逐渐引起黑质一纹状体DA系统逆行性变性,可部分模拟DA能神经元渐进性变性的特点。其病理、生化方面的表现同人类PD有不少相似之处,如黑质DA能神经元变性、死亡、缺失,胶质细胞增生,黑质和纹状体TH活性及DA含量降低。另一突出的优点是药物诱发的旋转行为的量化,是评价抗PD药物疗效稳定可靠的指标。缺点是该模型仍属急性损伤模型,不能模拟 PD慢性进行性病程特点,病理方面也与人类PD有一定差异(如无细胞内Lewy小体)。此模型可用于PD的发病机制及药物疗效判定、细胞移植治疗、基因治疗、神经保护治疗方面的研究。

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