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模型制备

吗啡依赖性(成瘾及戒断)动物模型(Model of addiction and withdrawal of morophine)

2019年01月29日 浏览量: 评论(0) 来源:《人类疾病动物模型复制方法学》 作者:周光兴 责任编辑:yjcadmin
摘要:阿片类药物(吗啡等麻醉性镇痛剂)均有成瘾性,成瘾性包括耐药性和身体依赖性。耐药性是指在多次用药后,镇痛剂的镇痛效果越来越弱,需要增加药量以期达到原有的镇痛效果。当突然停用镇痛剂时,人或动物就会出现流涎、呕吐、扩瞳、呼吸困难、中枢极度兴奋以及各种难以耐受的痛苦表情。这些异常的生理功能、行为功能紊乱现象称为“戒断症状”或身体依赖性,这表明已有了成瘾性。现在国际上评价阿片类药物身体依赖性的通用实验方法有三种。

阿片类药物(吗啡等麻醉性镇痛剂)均有成瘾性,成瘾性包括耐药性和身体依赖性。耐药性是指在多次用药后,镇痛剂的镇痛效果越来越弱,需要增加药量以期达到原有的镇痛效果。当突然停用镇痛剂时,人或动物就会出现流涎、呕吐、扩瞳、呼吸困难、中枢极度兴奋以及各种难以耐受的痛苦表情。这些异常的生理功能、行为功能紊乱现象称为“戒断症状”或身体依赖性,这表明已有了成瘾性。现在国际上评价阿片类药物身体依赖性的通用实验方法有三种。

1 依赖性实验的分类

1.1 自然戒断实验(spontaneous withdrawal test)

对实验动物(小、大鼠和猴)采取连续给药、逐渐增加剂量的方式给予受试药物,并于停止给药前使其剂量稳定一段时间。然后突然中断给药,观察并记录动物出现的戒断症状。

.1.2 催促戒断实验(precipitation withdrawal test)

在较短时间里受试药物以较大剂量、多次递增的方式给予动物,然后给以阿片类拮抗剂,催促其戒断反应的发生。若动物出现吗啡样戒断症状,说明受试药物与吗啡属同类型药物。催促实验戒断症状发作快、症状重且典型,持续时间短,因此便于观察比较。

1.3 替代实验(substitution test)

给予一定量的标准药(如吗啡)一段时间后,动物会产生身体依赖性。待身体依赖性产生后,停用标准药,替之以受试药物,观察动物是否出现戒断症状。如果替用受试药物后动物不出现戒断症状,说明这两类药物产生相类似的身体依赖性。这种试验亦称交叉身体依赖性实验(cross physical dependence test)。

无论是自然戒断还是催促戒断,动物都会出现程度不同的一系列征候或症状,即戒断综合征。但不是所有戒断征候或症状在一个受试动物身上都能出现。因此,在不同动物和不同实验时,应考虑几种衡量指标综合加以评价,如每种征候出现的时间、频率和严重程度等。

1.4 戒断症状分级

猴是国际上通用的评价阿片类药物身体依赖性的实验动物模型。其戒断症状的分级是根据Seevers等于30年代系统研究了吗啡、海洛因对恒河猴连续长期给药后提出来的。包括自主神经功能、生理功能和行为学变化的各种戒断征候和症状。

    1.戒断症状分级

    (1)轻度  症状有恐惧、打哈欠、流泪、颤抖、颜面潮红、出汗、啼鸣、争斗不和、食欲下降以及稀便。

    (2)中度  动物出现意向性震颤、厌食、竖毛、肌肉抽搐、抱腹、腹泻、无力,并呈躺卧姿势。

    (3)重度  症状进一步加重,出现极度不安、闭目侧卧、异常姿势、呕吐、面色苍白,并有明显的肌痉挛。

    (4)极重度  呈衰竭状态(包括无表情,呼吸困难,严重脱水)、体重下降达10%以上以及死亡发生。

    2.评分标准(级差分加症状分)

    (1)轻度  级差分5分,每个症状3分,同一症状一天内重复出现再计时减1分。

    (2)中度  级差分10分,每个症状4分,同一症状一天内重复出现再计时减1分。

    (3)重度  级差分17分,每个症状5分,同一症状一天内重复出现再计时减1分。

    3.评分依据

评分是根据症状和分级综合判断的,症状不同,得分应该有所区别,同一等级中症状种类的多少,得分应有区别,但不应比级差分值大。

    3个次级症状等于高一级症状分值,如3个轻度症状分(5+3×3)=1个中等症状分(10+4)。

    3个中等症状分(10+4×3)=1个重度症状分(17+5)。    若动物出现衰竭状态或死亡时,其他症状都看不到,故给的分值相当于轻、中、重症状分的总和。

    下面,分述常用的动物实验模型。

2 自然戒断试验(spontaneous withdrawal test)

自然戒断试验属于慢性实验,通常以剂量递增法给予受试药物,也可采用恒量法。给药方法可采用注射(皮下、肌肉、腹腔和静脉),灌胃,埋植药品片剂,还可采用掺食法和饮水法给药。

2.1 小鼠自然戒断试验(in mice)

小鼠主要采用掺食法和饮水法给药。选用体重为20~22g小鼠,雌雄各半,分为空白对照组、阳性药对照组和受试药物组。阳性药物可用盐酸吗啡或磷酸可待因,将其掺入料粉中(盐酸吗啡:1.0mg/1g料粉;磷酸可待因:2.0mg/1g料粉),喂养7d。第8日开始戒断,换上不掺药的料粉饲养小鼠。换料前一天称量小鼠体重,换料后每隔4h称一次体重,直至恢复正常为止。计算戒断后各时间点小鼠体重下降的百分比,进行组间t检验。

2.2 大鼠自然戒断试验(in rats)

(1)皮下注射法  健康大鼠,体重为200~220g,每组10只,雌雄各半。将实验动物随机分为阴性对照组、阳性药对照组和受试药物组,阳性药物用吗啡。以剂量递增法形成吗啡依赖性大鼠模型,周期为1个月。给药方法为吗啡皮下注射(sc),每天3次。前2周模型的给药剂量为5,10mg/kg体重各4d,15,20mg/kg体重各3d,注射量为0.1ml/100g体重。第3,4周剂量分别为30,40mg/(kg体重·d)。在停吗啡前一天称量大鼠体重,第29日停用吗啡,然后观察体重变化,每天称重3次,连续4d。求出各组大鼠体重变化百分比的平均值,进行统计学检验,以评价受试药物是否存在身体依赖性。

(2)药掺食法  健康大鼠,体重为200~220g,每组10只,雌雄各半。将实验动物随机分为阴性对照组、阳性药对照组和受试药物组,阳性药物可用盐酸吗啡或磷酸可待因。将受试药、吗啡或可待因掺入料粉中,一般每克料粉中含盐酸吗啡1.0mg或磷酸可待因2.0mg。每天称重消耗的料粉并更换一次料粉。用掺药的料粉喂养大鼠1周使其形成依赖性模型。第8日换以不加吗啡或可待因的料粉,使大鼠产生自然戒断,阳性对照组继续喂加吗啡或可待因的料粉。在戒断的3d内每隔4h大鼠称重一次。求出各组大鼠的平均体重变化百分率,进行组间t检验。

吗啡戒断后大鼠体重急剧下降,以24~36h最明显,是吗啡身体依赖性的最好指标。受试药物组的大鼠体重分别与阳性和阴性对照组的大鼠体重进行比较,以判断身体依赖性的潜力。体重下降作为身体依赖性的评价指标,比较客观,定量准确,已被广泛采用。

2.3 猴自然戒断试验(in monkeys)

(1)实验动物  应用猴子研究镇痛剂的依赖性较为理想,因为镇痛剂对猴子依赖性的表现与人较接近,戒断症状又较明显,且易于观察,已成为新镇痛剂进入临床前必须的实验。常用广西猴(恒河猴亚种),起使体重4~6kg,每组3只以上,雌雄搭配。

(2)实验方法

1)Seevers法  有两种基本方法:其一是快速递增法,吗啡的起始剂量为10mg/kg体重,并以每天10mg/kg体重的剂量递增,在2~6周达到其最大值115mg/kg体重,停药后猴出现严重的戒断症状;其二是用6~12个月或更长时间,逐渐增加吗啡剂量,给药总量与快速递增法相同,停药后也会出现上述的戒断症状。

2)Yanagta法  为改良Seevers法。以3.0mg/kg体重的剂量经皮下注射吗啡,每隔6h给药一次,连续给药至少60d,才能使猴形成吗啡依赖性实验模型。

3)综合法  经皮下注射吗啡3次/d,第1~3周剂量分别为3, 6, 10mg/kg体重,至第4周起给予15mg/kg体重,维持此剂量至90d。

(3)实验步骤  将猴随机分为阴性对照组、阳性药对照组和受试药物组。受试药物一般设3个剂量组,低剂量一般采用临床用药剂量;高剂量组根据药物特性选择相应剂量,对依赖性潜力低的药物应选用接近毒性反应的剂量,对毒性低的药物应选用最大耐受剂量;中剂量组的剂量介于高、低剂量之间。受试药物可采用恒量或剂量递增的方式给予。各组动物连续给药至90d时停止给药,停药后连续观察7d,每天观察3次,记录猴的各种行为表现并称体重。根据戒断症状等级评分并计算体重变化百分率。

3 催促戒断试验(precipitation withdrawal test)

催促戒断试验的关键问题是选择阿片受体拮抗剂。拮抗剂本身要有高度专一性,不具有其他的药理作用,不会妨碍戒断症状的评价。拮抗剂一般采用非肠道给药,使戒断反应最快出现,因此也有最大可能催出戒断反应。

3.1 小鼠催促戒断试验(in mice)

小鼠催促戒断试验是评价阿片类镇痛剂身体依赖性常用的筛选模型。

1.小鼠竖尾实验(erect the tail test in mice)

(1)实验方法  选用14~16g小鼠20或40只,平分为2组,分别皮下注射吗啡(按15mg/kg体重的剂量)和受试药物。给药后15min,吗啡组动物出现竖尾和不停地走动,2~4h后才趋于恢复。每组动物继续用药后,吗啡组动物竖尾现象更为明显。继续用药14~28d时,剂量增加到44mg/kg体重。然后皮下注射烯丙吗啡16mg/kg体重,再分别注射吗啡和受试药物。吗啡组动物竖尾现象消失,群集在一起,与生理盐水对照组非常相似。受试药物组与吗啡组平行观察,观察动物的外观症状,是否被烯丙吗啡所对抗,从而可以判定它是否属于吗啡类型药物。例如,证明延胡索乙素是不属于吗啡类型的。

另取小鼠40只,平分为2组。分别皮下注射受试药物和吗啡,然后进行交替实验。如:受试药物为延胡索乙素(80mg/kg体重),剂量逐增,至第21日时增加到200mg/kg体重;吗啡从35mg/kg体重增加到53mg/kg体重。于第22日起,延胡索乙素组注射吗啡53mg/kg体重后,动物表现为兴奋和竖尾,呈现吗啡样作用。吗啡组注射延胡索乙素200mg/kg体重后,动物出现严重的中枢抑制作用,四肢松弛,静伏笼内,作用的性质与延胡索乙素的作用相似。

(2)模型特点  小鼠竖尾反应与麻醉性镇痛剂的成瘾性有一定的平行关系。成瘾性强的药物,如海洛因、吗啡等的竖尾指数大;成瘾性弱的药物,如可待因,竖尾指数小。拮抗剂如烯丙吗啡不竖尾,并可以拮抗吗啡的竖尾反应,是快速鉴别药物的简易方法。

2.小鼠跳跃实验(jump test in mice)

(1)实验方法  选用20~25g雄性小鼠,每组10只。每12h按100mg/kg体重的剂量皮下注射吗啡,共14次。于末次注射吗啡6h后就能形成依赖性。按5mg/kg体重的剂量皮下注射纳洛酮催瘾,立即把小鼠放到一个高35cm、直径30cm的圆台上,观察纳洛酮注射后30min内的跳跃动物数。再于1.5、3及5h各观察记录一次。戒断症状在纳洛酮注射后30min内最强烈。此外还可观察到小鼠体重明显减轻、直肠体温下降(持续90~180min)、自发活动和对阵现象增加。

(2)模型特点  此方法是根据纳洛酮可诱发小鼠跳跃来评价镇痛剂的依赖程度。纳洛酮诱发小鼠跳跃是研究吗啡戒断的敏感指标,但不是吗啡样镇痛剂依赖性特有的现象,它可被其他药物所抑制。纳洛酮的作用时间短,戒断症状的观察应在纳洛酮注射后30min内进行。还可测定纳洛酮引发跳跃的半数有效量(ED50),根据其ED50值的大小可以判断受试药物身体依赖性的程度。此方法可用于筛选镇痛剂身体依赖性。其优点是经济、简便快速、指标明确、灵敏。

3.2 大鼠催促戒断试验(in rats)

大鼠形成吗啡依赖性后,给予阿片受体拮抗剂,动物在几分钟内就出现流泪、流涎、腹泻、咬牙、高度激惹、异常姿势等戒断症状,体重逐渐下降,大约在给拮抗剂后2h,戒断症状基本消失,体重不再继续下降。

(1)实验方法  健康大鼠,体重为200~220g,每组10只,雌雄各半。将其随机分为阴性对照组、阳性药对照组和受试药物组。以剂量递增法形成吗啡依赖模型,常采用1周或2周期试验模型。以皮下注射方式给予吗啡,3次/d,每次0.1ml/kg体重,给药剂量为5,10mg/kg体重各4d,15,20mg/kg体重的剂量各3d。第15日早上8:00末次给吗啡后40min皮下注射阿片受体拮抗剂进行催促戒断,常用纳洛酮的剂量为4mg/kg体重。随后立即将大鼠放入透明有机玻璃容器中,观察记录1h内大鼠的戒断反应症状,并于30、60min称大鼠体重,按戒断症状评分。也可采用在2d内用剂量递增法多次给吗啡后,注射纳洛酮的快速成瘾催促戒断法。

(2)大鼠催促试验戒断症状评分

    1)行为表现

    异常姿势:2分

    高度激惹、触碰:1分;靠近:2分

    咬牙  间断性:0.5分;延续性:1分    2)自主神经系统症状

    流泪  4分

    腹泻  软便:4分;不成形:8分

    流涎  轻度:1分;明显:2分

3.3 猴催促戒断试验(in monkeys)

模型的建立同自然戒断实验。皮下给药,起使剂量为3mg/kg体重,每6h一次,并逐渐递增剂量,可连续给药15d或30d。末次给吗啡后2h,皮下注射纳洛酮0.1mg/kg体重或烯丙吗啡1.0mg/kg体重,按猴的戒断症状分级标准,观察记录2h内动物的戒断症状,求出各组猴戒断症状分值和体重下降百分率的平均值。一般说来,戒断症状的严重程度与吗啡用药时间相关。从受试药物和标准药物对猴给药的时间和催促戒断症状所需的阿片类拮抗剂的剂量,可以判断受试药物致身体依赖性的性质和潜力。新药按上述吗啡猴的催促戒断试验程序开展试验,就能获得有关药物身体依赖性的资料。结合其他试验结果,可预测其对人的身体依赖性的潜力。

4 替代试验(substitution test)

替代试验是研究受试药物对阿片类药物戒断症状的抑制能力。通过与不同程度依赖性药物抑制戒断反应能力的比较,提供受试药物的身体依赖性与吗啡类似程度的实验依据。

4.1 小鼠替代试验(in mice)

健康小鼠随机分组,采用前述的小鼠自然戒断法建立吗啡依赖性模型。戒断吗啡后不同组别的小鼠分别给予吗啡、 L-美沙酮、哌替啶(度冷丁)、二氢吗啡酮等镇痛剂以及受试药物,比较受试药和上述麻醉性镇痛剂抑制戒断反应的能力,判断受试药物的身体依赖性与吗啡的类似程度。

4.2 大鼠替代试验(in rats)

可用上述多种技术建立吗啡依赖性大鼠实验模型。戒断吗啡后用受试药物代替吗啡给药(也可采取小鼠的实验方法,分别给予吗啡、L-美沙酮、哌替啶(度冷丁)、二氢吗啡酮等镇痛剂以及受试药物),按催促戒断试验中设计的戒断症状分值标准定量观察受试药物抑制戒断症状的程度。

4.3 猴替代试验(in monkeys)

猴替代试验是评价受试药物是否具有吗啡样作用的最常用的方法。猴子每天皮下注射吗啡2次,第1日剂量为9mg/kg体重,以后逐渐递增,第14日时剂量为53mg/kg体重,以此剂量维持下去。于给药后第14~21日时(总剂量约497~631mg/kg体重),猴子对吗啡成瘾。在每天注射吗啡前,往往是兴奋躁动或伏地不动。每当实验者接近时,会自动伸出前肢,让试验者给药,给药后则表现活动自如。于末次注射吗啡后停药16h,皮下注射烯丙吗啡2.8~7.9mg/kg体重作催瘾试验。给药后2~3min,猴子即出现戒断症状,先有震颤、恶心,以后出现抱腹躺地、打滚嚎叫等症状,以10~20min时最明显。此时皮下注射受试药物(应与吗啡等效剂量),观察受试药物是否可代替吗啡消除戒断症状。凡能替代者,说明该镇痛剂亦有成瘾性,与吗啡同属麻醉性作用类型;反之,则不属于该类型。例如,延胡索乙素在替代实验中,未观察到能减弱吗啡的戒断症状,并使戒断症状继续发展,导致猴子出现严重呼吸困难而死亡。如代替无效者即注射吗啡,于3~5min内,戒断症状明显减轻或完全消失,恢复如前,行动自如。

5 其他戒断实验(others withdrawal test)

5.1 大鼠摇体实验(body shaking test in rats)

(1)实验方法  雄性大鼠,体重为300~350g。麻醉后颈静脉安放导管,导管通过一个活塞连接到室外的注射系统。动物在整个实验过程中,均留在笼内。吗啡溶于无菌生理盐水中,递增给药5d以上。第1日,每小时注射吗啡1.5mg/kg体重作为维持量,共24h。每天逐量递增,第5日每4h注射吗啡15mg/kg体重。第6日以后,每6h注射吗啡15mg/kg体重作维持量,此时每个注射间隔期间内,大鼠出现明显的摇体反应。注射吗啡15mg/kg体重即可消除此反应。这种摇体反应在所有的大鼠均能反复观察到,因此是戒断症状的可靠指标。摇体计数可在吗啡注射后6h进行,观察30min。对照组注射或不注射生理盐水,按同法观察摇体数。另设吗啡对照组(15mg/kg体重静注后30min计数),观察其效应。

(2)模型特点  摇体现象是大鼠吗啡戒断症状的一种特征,类似落水狗刚爬上岸时,会出现头部和躯体的摇抖动作,以便把水甩落,故大鼠的摇体现象为湿狗样摇体。当大鼠出现吗啡依赖性后,脑内多巴胺受体过敏,使锥体外系统的神经递质功能失去平衡,因此出现摇体现象。由于该现象与吗啡戒断症状有一定的关系,已用它作为观察吗啡成瘾性试验的指标之一。需注意,摇体反应仅是与吗啡戒断症状的有关平行指标,而不是特异性的作用。由于脑内DA受体功能亢进可以受到DA受体激动剂和拮抗剂的影响,故必须排除实验中可能出现的假阳性或假阴性。

5.2 大鼠攻击实验(Attack Test In Tats)

(1)实验方法  雄性大鼠,体重为250~300g。吗啡按规定递增剂量,每天经腹腔注射给药3次,第1日为15mg/kg体重,以后每天增加15mg/kg体重。第9日为405mg/kg体重,此时每次注射吗啡135mg/kg体重,再以此剂量维持3~5d,而后停止注射吗啡。至2h时,大鼠出现体重减轻、摇体、眼睑下垂以及扭体等戒断症状。此时如果将大鼠同居一笼时,则出现互相攻击现象。攻击实验一般于末次注射吗啡3d后进行。将4只大鼠同居一笼,观察1h,记录对阵时程(即打架时前肢腾空相触,头面相对,后肢站起)、攻击和互咬次数。

(2)模型特点  攻击性反应也是成瘾性实验的观察指标之一。此实验实际上是反应吗啡成瘾使脑内多巴胺能神经系统的功能变化。停药后出现的戒断症状是多巴胺功能亢进的表现,而激动剂可增强攻击反应;拮抗剂能减弱攻击作用。因此,应用攻击实验作为戒断症状指标,也需要注意排除药物对多巴胺功能系统的干扰所产生的假阳性或假阴性。攻击症状出现的时程与其他戒断症状完全不一致。吗啡戒断后自主神经和躯体症状是在末次给药后24h出现,症状强度在72h明显减轻。而攻击现象在末次给药后24h是极不明显的,72h达到最明显。当其他戒断症状都减轻至最低水平时,攻击还十分强烈,甚至在末次给药后30d还可以看到很强烈的攻击现象。因此,观察需在停止注射吗啡后72h进行。

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