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【干货】抗体药的渐变之路

2019年03月18日 浏览量: 评论(0) 来源:百奥赛图 作者:百奥赛图 责任编辑:admin
摘要:20世纪90年代末,治疗药物主要由小分子化药主导。而在近几十年里,人类生命健康领域基于抗体药物疗法的使用呈现了指数级增长,并成为了治疗药物的一大组成部分。抗体已被证明在治疗包括癌症、自身免疫、传染病甚至神经退行性疾病在内的多种疾病方面具有广泛的用途[1]。FDA仅在2018年就批准了59款新药,创造了历史新高(图1)[2]。截止到目前,已有超过550种有希望的候选抗体处于不同的临床试验阶段。它们目前占全球100强药品销量的20%,而2007年这一比例仅为1%。[1,2]

20世纪90年代末,治疗药物主要由小分子化药主导。而在近几十年里,人类生命健康领域基于抗体药物疗法的使用呈现了指数级增长,并成为了治疗药物的一大组成部分。抗体已被证明在治疗包括癌症、自身免疫、传染病甚至神经退行性疾病在内的多种疾病方面具有广泛的用途[1]。FDA仅在2018年就批准了59款新药,创造了历史新高(图1)[2]。截止到目前,已有超过550种有希望的候选抗体处于不同的临床试验阶段。它们目前占全球100强药品销量的20%,而2007年这一比例仅为1%。[1,2]

图1. 自1993年FDA批准的创新药物[2]

抗体治疗药物的发展如此气势磅礴,小编在这里得给大家提两位大师,美国的生物学家Gerald Edelman 和英国的生物化学家Rodney Porter,因他们研究发现了抗体片段的原子分辨率结构,在1972年被授予了诺贝尔奖(图2)随后GeorgesJ. F. Kohler和Cesar Milstein两位科学家以此为基奠,利用杂交瘤技术获得了单克隆抗体(mAb),进而开启了现代抗体的工程时代。

Gerald Maurice Edelman    Rodney Porter

 图2. 1972年诺贝尔奖获得者[3,4]

单克隆抗体制备经典流程

单克隆抗体的产生得益于杂交瘤技术的发展,那么单克隆抗体是如何制备的呢?下面小编给大家简单概括一下,如图3所示:

①将抗原注射到小鼠体内,几周后取出脾脏并提取脾细胞;

②,③,④将小鼠的脾细胞与骨髓细胞融合以产生杂交瘤细胞,每个杂交瘤细胞无限地产生相同的抗体,然后使用抗原/抗体测定法筛选杂交瘤细胞,锁定那些能产生预期抗体的细胞;

⑤细胞也可以冷冻并保存以备后用。这种制备流程很好用,可以比较容易地产生大量相同的特异性抗体;

⑥将产生优选抗体的杂交瘤细胞再集合重新筛选多次,直至分离出纯系;

⑦,⑧这些细胞还可以在培养物中生长或注射到小鼠体内以诱导肿瘤。

图3. 杂交瘤法生产单克隆抗体流程图[5]

虽然上述方法已证明是稳健的并且仍广泛用于产生单克隆抗体,但在临床应用上却出现了一定限制。 


图片来源:soogif

    别急,别急,小编来告诉你。

    因为早期使用的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞来自小鼠,所产生的抗体来自小鼠的基因组(称为“鼠抗体”),它们在人体中具有免疫原性,人体免疫系统会将鼠的mAb识别为外来抗原并产生免疫应答(称为HAMA效应)

进入人体内的小鼠单克隆抗体很快就会从循环中排出,在某些情况下也会发生过敏反应。此外,小鼠mAb的恒定区(部分免疫细胞识别部分)不能正常与负责抗体作用的人类细胞上的受体相互作用。因此,小鼠单克隆抗体很少产生对人体所需的治疗效果,并且可能不安全。此后,科学家们纷纷开始向着mAb具备“人性化”的方向而努力。有一个很简单的解决方案就是使用人的B淋巴细胞代替小鼠的B淋巴细胞,但这并不奏效,因为一方面,来自人细胞的杂交瘤是不稳定的,人B细胞不会产生针对人体组织的抗体;另一方面,用一些抗原来免疫人类会带来安全与伦理道德问题。[6]

人鼠嵌合,人源化与全人单克隆抗体的开发

为了得到能够应用于临床上的mAb,科学家们坚持不懈的开发抗体。到目前为止,已开发出三个关键类型的抗体(图4):人鼠嵌合抗体(小鼠的可变区+人的恒定区),人源化抗体(小鼠CDR区+人的Igscaffold)和全人单克隆抗体(全人氨基酸)。[7]

图4. 单克隆抗体结构与类型[7]

  • Rituximab是嵌合mAb,其在临床上用于治疗非霍奇金淋巴瘤。不幸的是,小鼠可变区在许多情况下仍然被认为是外来的,这使得嵌合mAb的应用得到了一定的限制。[6-7]

  • Alemtuzumab是人源化单克隆抗体,一种白血病抗癌新药。人源化单克隆抗体在可变区域内,人类序列与小鼠序列之间存在进一步的交换,从而进一步降低免疫原性。但人源化单克隆抗体中存在鼠单克隆抗体残留的CDR ,这些抗体通常失去了它们的结合活性。理想的情况是在可变区域中减少鼠源残基,用以产生功能性而非免疫原性的人源化单克隆抗体。[6-7]

  • 全人抗体的出现:为了消除上述所有种类单克隆抗体的免疫原性问题,伟大的科学家们开始对小鼠B淋巴细胞进行改造,其抗体的所有部分改造成完全的人类基因。当这些小鼠被免疫时,它们的免疫反应将完全由人类抗体组成再配合使用标准的杂交瘤技术从这些小鼠的B淋巴细胞中获得完全的人单克隆抗体。[6-7]哇哦!这种“四两拨千斤”的做法简直是“鬼斧神工”了,有木有?
     

    可替代杂交瘤技术的抗体筛选方法

    说了这么多,小编想问问小伙伴们,除了上面介绍的利用杂交瘤技术获得抗体外,还有其他方法吗?  

  • 图片来源:网络

    ·     噬菌体抗体库展示技术-scFv单抗体的筛选

     噬菌体展示是一种替代杂交瘤的筛选方法,与杂交瘤相似,起点是免疫动物的B淋巴细胞。主要筛选流程

    1. 提取B-淋巴细胞RNA,反转录成cDNA首先提取,使用与抗体基因保守的引物,通过PCR的方法扩增抗体基因,构建文库;

    2. 利用基因工程将编码多肽或蛋白文库的DNA序列插入到噬菌体的外壳蛋白基因,多肽或蛋白就可以在噬菌体的表面上表达出来;

    3. 噬菌体再转化到宿主细胞内,成熟后,从宿主中释放出来;

    4. 用固定有靶蛋白的培养板捕捉能特异结合靶蛋白的噬菌体;

    5. 洗去未与靶点结合的噬菌体;

    6. 将与靶点结合的噬菌体洗被脱下来,再感染宿主细胞,繁殖扩增,进行下一轮淘选;经抗体片段在大肠杆菌中的可溶性表达与免疫分析(包括ELISA或流式细胞术)就可以得到想要的高亲和性抗体。[8,10]

  • 图5. 噬菌体抗体库进行scFv抗体筛选流程图[8]

    那么,这么做有什么好处呢?

    首先,并不是所有文库中表达的蛋白质表位都是有用的,这样可以筛选感兴趣的表位,以保证候选药物的活性最佳;

    其次,在体外实验中,可以筛选人源与非人源靶点,这就节省了临床前试验的时间。

    当然,体外筛选方法还有cDNA展示技术进行单域抗体(VHH)的体外筛选,核糖体展示技术筛选高亲和力抗体scFv片段,外周血抗原特异性B淋巴细胞的测序及亲和力测定等[1],小编就不在这里详细赘述了。

    ·     迅捷可靠的药物筛选途径 (药效筛选)

     经过上述体外筛选后,我们可以拿到一系列具有结合活性的抗体克隆,那么这些抗体克隆哪个才是最好的呢?

    此时,我们需要在体外对这些抗体进一步做亲和力分析,各种体外活性测试(ADCC,CDC等)和理化性质分析,选择出一款具备良好作用效果的抗体。

    当然,还有一种行之有效的办法可以替代这些体外活性测试,那就直接利用建立肿瘤模型的免疫检查点人源化小鼠在最初阶段对抗体进行筛选,获得体内药效最好的分子!如图6所示,将CMC阶段G抗体进行不同剂量的体内药效测试(靶点小鼠+MC38肠癌细胞系),依然具有较好的治疗应答。如此,便能通过体内药效拿到一款优秀的人源抗体候选药物,溜得飞起有木有?!

  • 图6. CMC阶段抗体体内验证(数据来源:百奥赛图)

    好了,今天小编就为大家科普到这。百奥赛图抗体药物研发服务平台,拥有高效的免疫方法,完整的先导抗体筛选过程,可利用各种靶点人源化小鼠对抗体进行体内药效筛选;平台还可对抗体进行工程化改造,体外活性测试以及理化性质分析等。如您有任何疑问,欢迎在下方留言,小编会及时回复哒~

    参考文献

    [1]Roland Kontermann ,Stefan Dübel. Antibody Engineering. Methods andProtocols hird Edition.2018.

    [2]Asher Mullard.2018 FDA drug approvals. Nature Reviews Drug Discovery 18, 85–89

    [3]https://baike.baidu.com/item/杰拉尔德·埃德尔曼/9559195?fr=aladdin

    [4]https://de.wikipedia.org/wiki/Rodney_R._Porter

    [5https://cellbiology.med.unsw.edu.au/cellbiology/index.php/File:Preparation_of_mAbs.jpg

    [6https://cellbiology.med.unsw.edu.au/cellbiology/index.php/Group_7_Project_-_Monoclonal_Antibodies#cite_note-hansel-15

    [7]Hansel,Trevor T.etal.The safety and sideeffects of monoclonal antibodies. NatureReviews Drug Discovery 2010, 9 (4), 325-38 DOI: 10.1038/nrd3003.

    [8]Frenzel A, Schirrmann T, Hust M Phage display-derived human antibodies in clinical developpment and therapy. MAbs. 2016 Oct;8(7):1177-1194. Epub 2016 Jul14.

    [9https://www.soogif.com/materialPage_baidu/r2Ch3hYz7LGDJWaYfdQT84UlwyT3CVGa9O3QF5i1pXVmhdn-MmF4MDDirMz1PWFa

    [10]https://wenku.baidu.com/view/da12be2d0722192e4536f615.html

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