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猪:大动物面部亚单位同种异体移植研究的新模型

2019年04月03日 浏览量: 评论(0) 来源:JPRAS Open Volume 12, June 2017, Pages 47-58 open access 作者:李晓菲译 责任编辑:admin
摘要:在血管化复合组织同种异体移植(VCA)实验发展的背景下,大鼠和人的耳廓模型已被描述过,而猪的耳廓模型则没有。猪耳移植是一种有趣的实验性复合面部亚单位同种异体移植。它的发病率和翻译性质都较低,主要是因为它由非常不同的组织组成。从这个角度出发,研究了猪耳部VCA亚单位的解剖学和外科学特征。
摘要:在血管化复合组织同种异体移植(VCA)实验发展的背景下,大鼠和人的耳廓模型已被描述过,而猪的耳廓模型则没有。猪耳移植是一种有趣的实验性复合面部亚单位同种异体移植。它的发病率和翻译性质都较低,主要是因为它由非常不同的组织组成。从这个角度出发,研究了猪耳部VCA亚单位的解剖学和外科学特征。我们对18头猪进行了研究:未做处理(n=12)或在颈总动脉(CCA)中注射乳胶(n=2)后解剖耳廓和颈部区域。采用选择性注射法(n=2)研究了耳后动脉和颞浅动脉的血管小体。以耳后动脉为动脉蒂建立手术获取方案,采用印度墨水(n=1)和血管CT(n=1)进行组织灌注研究。最后,在4头猪身上进行了2次原位同种异体移植,随后进行了一个短的观察期。耳后动脉被证明是耳的主要动脉,以确保完全的耳朵灌注。静脉引流依靠耳后静脉和头侧静脉,从上颌静脉和颈外静脉剥离。在生理条件下,同种异体移植证实了耳廓唯一后端动脉上的正常耳廓血管。我们描述了一种新的大动物实验性面部VCA亚基模型。我们的研究报告了一种可靠的获取方法和易于执行的单基动脉蒂移植。
 
关键词:猪耳  血管化复合组织同种异体移植  面部亚单位  大动物模型
 
简介:自从第一次将四肢和面部应用于血管化复合组织同种异体移植(VCA)以来,实验领域呈现指数增长。特别是,主要针对耳廓,在一些小型和大型动物中已经开发了几种用于VCA的面部动物模型,从全脸移植到亚单位模型。亚单位模型确实允许研究具有一整套不同组织的新免疫抑制方案,同时降低动物的外科发病率。然而,小动物缺乏临床前的尺寸和接近人类免疫系统的尺寸:相反,猪在大动物模型中提供了这些优势,因此已经在该物种中进行了一些实验研究。因此,血管化猪耳亚单位模型是大型动物VCA研究和其他孤立器官研究的相关模型,涉及弹性软骨相关亚单位。此外,耳廓具有高度特征性的形状,除骨和粘膜外,还包含面部结构中涉及的所有主要组织类型:皮肤、软骨、脂肪组织,甚至肌肉。与更广泛的面部移植相比,其获取和移植的发病率更低。然而,由于迄今为止所有的外科解剖学研究都主要集中在面部前部和面神经分布上,因此目前的文献中缺乏对该亚单位的精确解剖学知识。此外,为了简化移植方案,我们假设一个可靠的耳廓可以在单个耳后动脉上获得。因此,我们研究了耳廓的组织血管解剖和灌注。最后,我们将我们的解剖发现应用于耳亚单位的设计、获取技术,并随后进行了体内同种异体移植试验研究。
 
动物:对14头猪进行了解剖学研究:13只雄性小猪(5–7公斤)和1只成年猪(50公斤)在安乐死后立即用于其他实验。乳胶注射研究:在两个头部,双侧颈总动脉(CCA)注射红色乳胶。然后将头部储存在?20°C,并在解剖前在室温下解冻过夜。对耳后动脉(CAA)的分支形态进行了观察。记录CCA、颈外动脉(ECA)、CAA、颞浅动脉(STA)和耳前动脉(RAA)的长度和口径。
 
血管小体研究:在两个头部,分别用70毫升亚甲基蓝(MB)与生理盐水混合在CAA(n=4)和70毫升红色伊红(EO)与生理盐水混合在STA(n=2)中,在恒定的手动压力下对STA和CAA进行双边鉴定并制备选择性染料注射。然后对染色的耳朵和邻近的表皮进行灌注强度和面积的评估。
 
移植耳廓获取:颈部切口线从臂间切口的水平向下画至位于下颌角后方的点,沿着下颌支向下延伸至中线。在切开浅表肌肉后,暴露腮腺和腮腺肌。然后,将面静脉、上颌静脉和颈外静脉(EJV)暴露于耳后静脉(CAV)和耳前静脉(RAV)的远端。在这个平面上,可以发现大耳神经的敏感分支。随后,暴露颈部的神经血管束:CCA、颈内静脉(IJV)和迷走神经从侧面到气管和喉。为了达到完全暴露CCA的目的,通过髁旁截骨术将ECA及其络脉、带状肌肉、下颌腺、胸腺和舌下神经完全切断。然后在耳朵底部做一个环形切口,包括软骨口。然后,从PA肌肉开始顺时针方向,切除外耳肌。术前固定环形软骨和耳软骨,CAA刚好在耳外耳道(EAM)的正后方。耳廓从外侧到内侧持续抬高,包括深颞筋膜和耳廓脂肪垫,沿着椎弓根一直到颈部。最后,EJV和CAA,最终扩展到CCA。在离体耳廓上,用肝素盐水插管和灌注CAA,直到观察到正确和清晰的静脉回流。
 
血管CT扫描:将100毫升生理盐水与3克明胶粉和40克硫酸钡在加热至40°C的水浴中混合,给两只小猪和一只成年耳廓皮瓣注入10-15毫升对比溶液。注入的耳朵保存在4°C。?在256层多探测器CT扫描仪上进行计算机断层扫描采集。使用标准的三维可视化工具对重建图像进行分析。
 
墨水灌注与组织学:在一个头部,一个耳廓瓣被注入15毫升用盐水(1:1)稀释的黑色印度墨水。从耳廓、耳根和脂肪垫采集全厚度活检。将样品固定在4%甲醛中过夜,嵌入石蜡中,切片,并用马松三色染色。
 
体内同种异体移植:在使用替利他明/唑拉西泮(6 mg/kg)和二甲苯嗪(2 mg/kg)肌肉注射进行术前麻醉,气管内插管和2%异氟醚诱导全身麻醉(GA)。必要时在术中给予10 mg/ml溴化罗库溴铵。所有的手术步骤都遵循先前描述的方案,两个供体的动脉蒂延伸到左耳的CCA。在椎弓根夹持前40分钟给予全身肝素400 ui/kg。移植体在4°C下保存,直到移植。每只动物最后都用盐酸丁卡因静脉注射安乐死。受体原位准备、移植和监测:左耳廓自然移植后,保存软骨口、耳外肌切片和EAM用尼龙缝线标记。受者EJV和CCA暴露。皮下皮肤皮瓣升高,达到腮腺的后边界。EJV通过血管环进行识别和固定。胸骨瘤样肌被识别出来,然后在大肌分裂后向内侧收缩暴露CCA。此后,移植物被固定在受体软骨上。夹持前给予全身肝素。动脉端对侧CAA-CCA吻合,静脉端对端EJV-EJV吻合。此外,在移植的耳静脉中插入一根导管,并注入10毫升肝素盐水。最后,通过皮下尼龙缝合实现皮瓣闭合。夹持松解后,在GA下,在皮肤闭合前后监测皮瓣再灌注1小时的体表变化、充血和血氧饱和度。后对动物进行安乐死。
 
结果:仔猪动脉形态计量与分布:CCA的平均口径为3±0.3 mm,长度为50±7 mm,侧支恒定,即从尾侧到头侧的方向:在一个共同的躯干上观察到的头侧喉动脉、头侧甲状腺动脉、枕动脉和颈内动脉;咽升动脉;和头侧喉动脉。平均口径为2.6±0.2 mm,长度为22±5 mm的ECA与CCA直接相连,穿过舌下神经后出现以下侧支:舌动脉、面动脉、CAA和腮腺分支。在穿过下颌支后不久,ECA终止为STA和上颌动脉。STA会产生一个到咬肌的分支,一个到耳前淋巴结的分支,面部横动脉和RAA:后者的平均口径为0.5±0.1 mm,长度为26±3 mm。CAA平均口径为1±0.2 mm,长度为27±6 mm,向腮腺和耳前淋巴结分支。在CAA的耳内过程中,观察到耳廓、耳根和耳内、外耳肌的多个分支。RAA过程与CAA平行,更难清楚地暴露出来。远端的CAA在耳廓软骨的后侧运行,并在前皮肤上形成多个穿孔分支。
 
血管小体:CAA灌注区包括整个耳廓,耳廓前后两侧染色强烈,涉及整个植入基础。此外,染色覆盖头皮后部,没有中线交叉。STA灌注区覆盖了整个耳朵,但其强度比CAA低。染色延伸到头面部区域而不穿过中线.结合STA/CAA注射,在耳部灌注方面,CAA染色区域占主导地位。移植片平均重量为40.4±3.7g,生理盐水灌注后,所有获取的耳朵均能通过EJV获得满意的静脉引流,这与整个皮瓣的增白有关。随后,通过耳后大静脉的空虚证实有足够的流出,表明血管网被充分冲洗。
 
离体耳CT成像与组织学:在所有标本中,CT扫描三维重建显示整个耳移植血管树完全灌注,完全扩展到整个实质区域。印地安墨水注入耳朵,证实了EAM染色。在组织切片上,在小动脉毛细血管床的管腔中检测到墨水。在耳廓下半部分的活检中,所有主要的组织——皮肤、脂肪组织、软骨和肌肉——可以很容易地同时进行评估。
 
体内同种异体移植研究;供者与外植耳(受体)的平均重量分别为200±10 g和189.5±29.5 g。对于第一对移植配对体,移植物动脉蒂总长为94 mm,有43 mm CCA、21 mm ECA和30 mm CAA。上颌静脉与吻合口之间的EJV长度为60 mm。EJV的供体/受体口径为5.9 mm/6 mm,CCA为3.8 mm/3.9 mm;皮瓣CAA口径为1.6 mm。在第二对移植配对体中,移植动脉蒂的总长度为100 mm,有45 mm CCA、20 mm ECA和35 mm CAA。EJV长度为62 mm。EJV的供体/受体口径为5 mm/6 mm,CCA为3.4 mm/3.5 mm;皮瓣CAA口径为1.5 mm。静脉和动脉吻合的总时间分别为33和29分钟,没有特殊的技术困难。温、冷平均缺血时间为1.5/3小时。在吻合完成时,总手术时间为210±45分钟(供者获取)和190±30分钟(受者植入)。移植的耳朵呈现快速均匀的再灌注,静脉和动脉通畅良好。在随后的20分钟内,耳朵出现了一些充血现象,但通过插入耳后静脉的导管额外灌注肝素很快就消失了,毛细血管充盈满意。耳周和颈周皮肤闭合后,灌注和静脉引流仍令人满意。移植体定位于受体部位并易于缝合,具有良好的形态重建效果。
 
结论:我们在猪模型中对耳移植的外科解剖和技术进行了广泛的描述,为大型动物实验性VCA提供了一个新的亚单位模型。该模型中的肌肉成分为大型动物的免疫研究提供了重要的价值。本研究中关于猪耳亚单位移植的解剖和外科发现是进一步研究延长体内原位同种异体移植的第一个基本步骤,允许测试VCA耐受诱导的新实验方法和创新组织工程策略开发的研究。
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