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实验方法

小型猪的术后护理、处死以及取材

2019年04月08日 浏览量: 评论(0) 来源:《心血管病实验动物学》 作者:霍勇 陈明 主编 责任编辑:yjcadmin

 1.小型猪的术后护理  小型猪的术后护理相当重要,如果没有得到足够的重视,则很有可能导致实验动物的非正常死亡,尤其在小型猪术后最初的72小时内,尤其需要严格护理。因此,术后护理工作应该得到与置入手术相同的重视程度。

小型猪护理的最终目的是使实验猪在所试验条件下(指药物/手术)维持正常的代谢反应,或早日康复,使实验顺利完成。对实验猪的护理要做好以下几方面的工作:适宜的生活环境,科学的饲养,严格的管理制度。

适宜的环境,主要是指饲养实验猪的动物房内温度、湿度、有害气体的含量(空气净度)。实验猪对环境的要求比一般生产型猪要高,因为它已经处于实验条件的应激下而不是正常的生理状。机体的抵抗力及免疫能力下降,不良的环境可以造成试验猪患病或导致死亡,影响实验完成。猪房的温度要求18~25℃,空气相对湿度55%~65%,猪房内需备有空气交换即排风设备,以及时排除有毒的氨气,硫化氢等有毒气体,增加空气的流动性,降低有害气体的浓度。

实验猪的饲料营养要高于生产型猪,以满足康复和抵抗药物应激所消耗养分的需要。饲料的喂量不能过量,手术后料量渐增,体重<10kg的实验猪日喂量为0.3~0.5kg/d,体重10~15kg的实验猪日喂量为0.5~0.7kg/d。小型猪术后应每天坚持应用阿司匹林300mg以及氯吡格雷75mg至处死。

实验猪的管理包括两大方面的内容:①严格按实验的要求及时注射、给药、外伤换药,并按要求观察记录,收集粪尿标本,整理资料;②及时发现实验猪的异常现象,给予相应处理。对试验猪的观察内容主要看粪尿有无异常(排量、形态及颜色等),食欲变化,皮肤有无疱疹、脱毛现象,可视黏膜的颜色、湿度、出血现象等,形态行为异常如全身颤抖,可查一下体温,其他的内脏病或中毒等,精神委靡不振,黏膜苍白常见于贫血,猪在笼子上蹭痒常见于寄生虫或过敏,观察肛门是否水湿,常见于下痢,鼻镜干燥是体温较高的表现,腹部上抽腰背拱起是肠道疾病的表现,呼吸频率快,胸腹呼吸,鼻镜发紫,是呼吸困难的表现,发现猪在笼子中打转,伴呼吸困难需考虑脑炎或中毒性疾病,发现猪卧地不起要检查猪的四肢是否有伤,如果同时伴有精神不振需怀疑全身内科疾病等。一旦发现异常情况,应及时对症处理。

实验猪的注射给药方法:一般为皮下注射,静脉注射,肌肉注射和腹腔注射。皮下注射是指颈部及股内侧,肌肉注射主要指肌肉发达,神经血管较少的颈部和臀部。给猪投药一般使用一个长颈瓶或容器,通过嘴角压住舌面,缓缓投入;或者用导管投入。有些少量粉剂可以调成糊状,抹到舌面上,靠唾液自行吞咽下去。

2.小型猪的处死以及支架段标本的取材

(1)小型猪的处死过程应遵循3Rs原则,即进行安死术(euthanasia),即达到没有惊恐或焦虑而安静地、无痛苦地死亡,最大程度上避免实验动物的痛苦。因此均需要较为深度的麻醉,以达到实验动物神经系统立即达到失去痛觉的早期抑制作用。如果可能,即将处死的动物不应和其他动物在同一个房间里。安乐死之后,确认动物死亡非常关键。死亡症状有心跳、呼吸停止,反射缺失。可通过放血或取出心脏,毁损大脑,断头,切除内脏,出现尸僵等来确保动物死亡。

小型猪动物模型中的处死多采用放血法或心腔注射氯化钾法。前者在实验动物深度麻醉后,即从股动脉鞘管开始放血,建议应用7F动脉鞘管以及强化肝素化以保证放血通常,此种方法相对方便,但处死时间相对较长,若鞘管被血栓堵塞则无法进行。而心腔内注射氯化钾方法相对迅速,予15%氯化钾溶液10~20ml心腔内注射,可是心脏骤停于舒张期。但心腔内注射有一定几率损伤支架段冠状动脉,操作时应尽量小心。

(2)小型猪冠脉标本的取材(图5-8):待小型猪被处死之后即刻开始血管标本的取材,以保证标本的新鲜。首先在分离胸前皮肤肌肉组织,暴露肋骨,用开胸器分离肋骨或直接折断心脏前两根肋骨以充分暴露心脏。徒手尽量钝性分离周围结缔组织,必要时需用眼科剪剪开壁层心包,若小型猪出现心包粘连,则对取材造成一定困难。找到升主动脉以及肺动脉后,用手将其提起,在远段离断,即可把心脏完整托出。注意一定避免在上述操作过程中,损伤到支架血管段,尤其是将支架压扁以及用锐器损伤。因此操作用时刻注意支架位置以及尽量避免过多使用锐器。

心脏分离出来后应立即开始加压灌洗。根据标本的用途不同,灌洗液分为中性甲醛(福尔马林)、戊二醛以及PBS液等。

1)10%中性甲醛:自行配制,配制过程如下:①0.2mol/L PBS(pH 7.4):A液(0.2M NaH2PO4):NaH2PO4·2H2O 3.12g,加蒸馏水至100ml;B液(0.2M Na2HPO4):Na2HPO4·12H2O7.16g,加蒸馏水至100ml;19ml A液与81ml B液混合即为0.2mol/LPBS。②0.01mol/L PBS(pH 7.4):0.2mol/L PBS(pH 7.4)50ml,NaCl 8.5g,加蒸馏水至1000ml。③10%中性甲醛:甲醛溶液250ml,加0.01mol/L PBS(pH 7.4)至1000ml。

2)3%戊二醛固定液:自行配制,配制过程如下:①2mol/L PBS(pH 7.2):A液:KH2PHO42.722g加蒸馏水水至100ml:B液:Na2HPHO4·12H2O 7.163g加蒸馏水至100ml;A液:B液=1:4。②3%戊二醛固定液:2mol/L PBS(pH 7.2)1000ml加50%戊二醛120ml。

灌洗过程应用专门的灌洗设备,保证100~120mmHg压力进行灌注。灌注时夹闭肺动静脉以及主动脉分支,从升主动脉断端插管进行灌洗,灌洗时间20~30分钟。灌洗后可见心脏充分膨胀,冠状动脉血管清晰可见(图5-9)。

灌洗后即可开始取材。有时支架段血管已清晰暴露,因此可直接在支架段血管部位进行仔细分离。有时支架段血管被脂肪组织掩盖或实验动物出现心包炎等,增加取材困难,此时可考虑从左主干开始仔细分离,以避免不必要的损伤。

操作时应注意尽量去除血管外膜外的脂肪组织和结缔组织,但要小心避免损伤血管本身,对于有些明显正性重塑的血管周围结缔组织异常增殖,可考虑整体取材,以避免修剪时损伤支架。

取材后应迅速投入相应的装有固定液的容器中,避免容器过小从而无法充分固定,理论上至少应用10倍标本体积的固定液进行固定。若进行分子生物学研究的标本,应尽量在冰上操作,动作应尽量迅速,取材后马上投入液氮中。

取材时除支架段血管外,应同时取材支架两端loram的冠状动脉以及支架血管段两侧10mm内的心肌组织,以进行相应的组织形态学和病理分析。

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