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疾病与药物研究

如何在体外培养类器官?创作培养皿中的3D微电影

2019年04月29日 浏览量: 评论(0) 来源:邦耀生物 作者:邦耀生物 责任编辑:admin
摘要:如果把培养皿比作是一个荧幕,那么2D细胞培养记录的是一帧一帧的画面,它生动地展示了细胞中的部分秘密,但却始终无法多层次地揭示来源组织的结构和功能。3D细胞培养则将器官特异性的细胞集聚一堂,以体内相似的方式分化来实现自我组建,以类器官为主角全新演绎出了更精确的人体组织微电影。本期,让我们一起窥探幕后花絮,看看如何在体外培养3D类器官?
​前言
 
如果把培养皿比作是一个荧幕,那么2D细胞培养记录的是一帧一帧的画面,它生动地展示了细胞中的部分秘密,但却始终无法多层次地揭示来源组织的结构和功能。3D细胞培养则将器官特异性的细胞集聚一堂,以体内相似的方式分化来实现自我组建,以类器官为主角全新演绎出了更精确的人体组织微电影。本期,让我们一起窥探幕后花絮,看看如何在体外培养3D类器官?
 
类器官定义及特点
 
类器官(organoids)-- 通过在体外培养胚胎或成体干细胞,让其增殖分化形成具有一定形态结构及功能的类似于器官的3D细胞团结构。这些细胞结构虽然不是真正意义上的人类器官,但能在结构和功能上模拟真实器官,因此,其在科学研究中发挥着越来越重要的作用。与传统的2D细胞培养相比,3D类器官具有哪些优势呢?
 
表1. 2D细胞与3D类器官的比较
 
如下图,TOSHIRO SATO,等人在体外分离并培养鼠源的Lgr5-GFP阳性细胞,4-5天后单个细胞会逐渐增殖分裂形成一个类似于花环状的囊状细胞团,即为类器官[1]。这个囊状细胞团里不仅含有Lgr5类型的干细胞,而且还有Lysozyme阳性的潘氏细胞,Muc2阳性的杯状细胞,ChromograninA阳性的肠内分泌性细胞,及Villin阳性的肠上皮细胞。这暗示着肠干细胞不仅能够实现增值而且能分化形成各种细胞,并且类器官在体外能传代培养长达2年,同时保持其增殖和分化的特性。
 
 图1. 单个的Lgr5-GFP会逐渐增殖分裂形成类器官的过程[1]
类器官的应用
 
3D类器官目前主要在个性化医疗、人类器官发育研究、疾病机制研究和药物筛选等方面均有重要作用。往期我们已经为大家详细介绍过,具体可见链接:精准医疗时代已经来临,这种名为"3D类器官" 的新工具你了解吗?
 
类器官培养
 
类器官培养从2009年发展至今,培养体系已经十分成熟,然而与传统的2D培养差距仍较大,如果没有专业的技术指导,初次尝试在体外构建类器官,还是有一定难度。现在我们就以小鼠的小肠类器官为例,详细地讲述构建类器官的过程!
 
基本过程:简单来说就是从组织分离出胚胎或多能干细胞,将它们培养在一个支持介质(如基质胶Matrigel)上,使其能够三维生长成包含多种已分化的细胞类型的类器官。
 
图2. 在体外构建小鼠小肠类器官的流程
一、实验前准备
 
解剖工具,灭菌PBS(预冷且加入双抗),基质胶matrigel(BD Biosciences,提前2-3h于冰上化冻),24孔板置于培养箱中预热。
 
二、完全培养基的配制(基础培养基添加生长因子)
 
基础培养基
 
B27 50x (Invitrogen)
 
N2  100x (Invitrogen)
 
N-Acetyl-L-cysteine1mM (Sigma-Aldrich)
 
Glutamax100x (Invitrogen)  
 
HEPES  10mM (Invitrogen)
 
Primocin500x  (Invitrogen)
 
AdvancedDMEM/F12, ADMEM (Invitrogen)
 
生长因子 
 
Mouse-EGF(鼠源的表皮生长因子)50ng/ml (Invitrogen),m-EGF和小肠的增殖相关;
 
HumanR-spondin1 500ng/ml (WNT信号的激动剂)(Peprotech),诱导体内隐窝增生;
 
Mouse-noggin(BMP的抑制剂) 100ng/ml (Peprotech)  能诱导隐窝数目的扩增。
 
注:培养基配置时一次不要太多,建议一次配20ml,配制好后用0.22um的滤器过滤(过滤的目的是除菌),置于4℃可保存4周。
 
三、隐窝分离及接板
  1. 解剖6-8周的小鼠,取胃以下约10cm的小肠,镊子去肠系膜,剪刀沿肠道剪开,用预冷的PBS洗3-5次,用载玻片小心的将小肠表面的绒毛刮去(显微镜下镜检),将刮好的小肠放入50ml离心管中,置于冰上;
  2. 将小肠转移至生物安全柜中,用含双抗的PBS清洗3-5次,将小肠转移至25ml 2mM的EDTA(PH=8.0)的溶液中4℃冰箱中消化25min;
  3. 将消化好的小肠转移至50 ml离心管中用含双抗的PBS 清洗2次;
  4. 加入25ml PBS适当摇晃20-40下,取部分悬液镜检直至能看到大量的隐窝。悬浮液用70um的过滤筛过滤到新的50ml离心管中;
  5. 重复步骤4,两次收集的滤液800rpm 离心5min;
  6. 弃上清,用2ml的ADMEM重悬沉淀,取适量的悬液计数;隐窝的数量控制在10-15个/ul 最佳;
  7. 取适当体积的悬液加入到1.5ml的离心管中,室温下800rpm离心5min;
  8. 弃上清,用预冷的matrigel重悬(需充分混匀);
  9. 接板,24孔板接50ul的重悬液(将matrigel种在孔中间避免贴壁);
  10. 将接种好的板于培养箱中放置20-30min;
  11. 每孔加500ul完全培养基,然后每隔2-3天换一次培养基,5-7天传代一次。
注:所有的操作都要避免染菌,且组织需尽可能至于冰上。
 
四、Organoids传代
  1. 将传代的隐窝冰上放置5-10min;
  2. 小心吸出上清,并加入预冷的1ml 的ADMEM用大枪头将matrigel打碎,然后调制700ul量程,吹打30下左右,此过程避免产生气泡。可取适量的悬液观察,直至看不到大块的隐窝为止;
  3. 将悬液转移至1.5ml离心管中,室温800rpm离心 5min;
  4. 后续接板步骤与隐窝接板步骤第8-11步一样。
注:理论上传一次可以扩增3-5倍,但由于操作过程中的损失,因此一般只能扩增3倍。
 
五、Organoids 的冻存及复苏
 
冻存时,注意培养基不同,配方为10%的DMSO,20%FBS,ADMEM补足,将悬液转移至冻存管后,放入冻存盒中于-80℃冰箱中保存24h,如需长久保存,则24h后放入液氮罐中保存。复苏步骤与复苏一般细胞相同。
 
六、Organiods 评价
 
如下图所示,为成功培养的小肠3D类器官示意图:
 
 图3. 构建成功的小肠类器官
 
备注:左:接板后第一天的小肠类器官,箭头所指为刚变圆隐窝,清楚可见paneth细胞;右:接板后第5天的小肠类器官,箭头所指为出芽的类器官
 
七、常见问题及解决方法
 
隐窝消化时间过长导致存活率过低?--减少消化时间及摇晃隐窝次数
 
类器官存活但不能出芽?--可能是生长因子失活或培养基放置过久,可更换生长因子或重新配置培养基
 
类器官的污染?--加双抗及注意无菌操作
 
传代时隐窝存活率低?--传代的前三天加Y276302,ROCK抑制剂可抑制细胞失巢凋亡
 
 
幕后揭秘到这里就结束了,很荣幸我们邦耀实验室也曾出品过两部关于类器官的3D微电影。2016-2017年,我们实验室先后利用了小鼠及人的肠道类器官构建了筛选P-glycoprotein (P-gp)抑制剂的模型,证实了肠道类器官作为筛药模型的可行性[2-3]。
 
P-gp主要是将内源性物质、外源性物质(如药物)以及毒素排出细胞外,是机体抵御不良环境的一道天然屏障,但同时也是限制口服药物吸收及抗药耐药长生的主要因素。P-gp在体内表达于小肠绒毛区域,而在类器官中表达于类绒毛区即花环状的内圈部分。我们分别利用P-gp 的一代,二代及三代抑制剂分别进行试验,发现均能达到较好的抑制效果。
 
图4.  P-gp在小鼠小肠及类器官中的表达[2]
 
上面就是本期为大家奉上的精彩内容了,大家如果对3D类器官培养感兴趣,欢迎参与下方群聊或者留言讨论!
 
关于邦耀
 
上海邦耀生物科技有限公司成立于2013年9月,是一家以基因编辑技术引领创新、探索和开发突破性的疗法、预防和治疗威胁生命的疾病、造福全人类为使命的高新技术企业,总部位于上海紫竹科学园区。邦耀生物依托在基因编辑、免疫学领域的强大技术实力和科研团队,致力于基因突变引起的遗传疾病的基因治疗、以及基因编辑与细胞治疗的研发与转化,现已成功构建通用型CAR-T的研发转化平台,并拥有两个1000平米独立的GMP中试基地,用于开展基因与细胞治疗的系列转化研究与生产;另外,邦耀下设两个独立团队,分别专注于免疫及肿瘤药物研发和CRO服务,在加速自身研发与转化的同时为客户提供优质的产品和技术服务。
 
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参考文献:
 
[1]  Sato, T., et al. (2009). "Single Lgr5 stem cells buildcrypt–villus structures in vitro without a mesenchymal niche." Nature459(7244): 262-265.
[2]  Zhang Y, Zeng Z, Zhao J, et al. Measurement of Rhodamine123 in Three-Dimensional Organoids: A Novel Model for P-Glycoprotein InhibitorScreening[J]. Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology,2016, 119(4):349-352.
[3]  Zhao J, Zeng Z, Sun J, et al. A Novel Model ofP‐Glycoprotein Inhibitor Screening Using Human Small Intestinal Organoids[J].Basic Clin Pharmacol Toxicol, 2017, 120(3):250-255.
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