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实验方法

转基因小鼠的制备方法

2019年05月27日 浏览量: 评论(0) 来源:《常见人类疾病动物模型的制备方法》 作者:秦川 责任编辑:yjcadmin
摘要:转基因小鼠的制备一般由专业实验室或商业化服务机构完成,涉及的研究技术主要是转基因载体构建、DNA纯化、基因型鉴定和品系维持。本章着重介绍和一般研究者相关的转基因载体构建、基因型分析和转基因鼠的饲养技术。

转基因小鼠的制备一般由专业实验室或商业化服务机构完成,涉及的研究技术主要是转基因载体构建、DNA纯化、基因型鉴定和品系维持。本章着重介绍和一般研究者相关的转基因载体构建、基因型分析和转基因鼠的饲养技术。

1转基因载体

1.1可以根据研究项目的不同选择转基因载体

质粒载体(plasmid)一般不超过12kb(13~15kb亦可,但操作上比较困难)。

逆转录病毒载体(retroviral vector)质粒可以超过12kb,其中病毒包装区一般不超过8kb,大于8kb后不易完成病毒包装过程。

黏粒(cosmid)不超过45kb。

酵母人工染色体(YAC)和细菌人工染色体(BAC)都能携带300万以上碱基的DNA片段。

DNA片段的大小对转基因的效率影响不大。

1.2转基因载体的设计

启动子:在实施转基因之前,首先是选择启动子,主要有如下几类启动子可供使用:

1.系统表达启动子;

2.组织特异启动子;

3.可诱导启动子;

4.时空特异启动子。

5'非编码区:5'非编码区是同核糖体识别并启动翻译的重要区域,不同基因在5'非编码区具有不同的结构特点,构建载体时要注意靶基因的5'非编码区的结构。

编码区:编码区的遗传密码在不同物种中有所偏爱,如:在小鼠中表达细菌、植物或其他种类动物的基因时,应把一些密码置换成小鼠偏爱的同义密码子,这样可以提高表达效率。分泌蛋白的分泌信号区可以同非分泌性蛋白靶基因融合形成分泌性蛋白。具有特异细胞定位的蛋白基因同靶基因融合可形成特异细胞定位的融合蛋白。在靶cDNA 5'端加一个内含子可以提高表达效率。

3'非编码区:cDNA 3'非编码区一般比较长,并含有控制 mRNA翻译和稳定性的多种信号,如果使用商业化的表达载体,一般都已具备了3'非编码区元件。

终止子:终止子提供Poly(A)结合蛋白和起始复合物的相互作用位点,是转基因的关键。商业化的表达载体一般包含终止子。

IRES序列:在同一个载体中表达一个以上的基因时,可以在两个基因之间插入IRES序列,IRES序列可以使两个基因分开翻译成不同的蛋白。现在有一些含有IRES序列的商业化的载体。

转基因小鼠完成后,影响外源基因表达的因素可能有如下几个:

1. 5'非编码区的结构不合理;

2.编码区的序列有待优化;

3.过早地遇到终止密码;

4.编码区有沉默子或RNA剪切;

5. 3'非翻译区的结构不合理;

6.启动子选择不合理;

7.靶基因染色体插入位置的位置效应。

2 DNA的制备与纯化

2.1试剂用水

分子生物学实验中,水是问题的主要来源,在制备DNA的过程中,所用的水必须是18MΩ以上的去离子水。

2.2 DNA纯化

质粒DNA一般应用大量或中量制备。用足以获得5~20μg插入片段的质粒DNA进行酶切,制备大的琼脂糖胶分离DNA片段,用凝胶纯化试剂盒纯化后,再经以下步骤来完成:

1.DNA用等体积酚-氯仿抽取两次。

2.再用氯仿抽取两次。

3.加入1/10体积的2mol/L NaCl和3倍体积的无水乙醇,于-20℃过夜。12000×g离心10min,沉淀DNA,70%乙醇洗两次,空气干燥。

4.干燥后的DNA沉淀以小于或等于25ng/μl的浓度溶解于显微注射缓冲液中(0.1×TE,1mmol/L Tris,0.01mmol/L EDTA, pH=7.4),终体积为100~300μl。置透析袋中,在4℃对500ml显微注射缓冲液透析过夜。-20℃冻存以备显微注射。也可用 Sephedex G50脱盐代替透析。

Sephedex G50脱盐程序如下:

(1)加1ml Sephedex G50悬液到1ml柱子里。

(2)3000转/分,离心2min,柱床体积约500μl。

(3)加500μl 0.1×TE缓冲液到柱子里,3000转/分离心2min。

(4)重复第3步3次。

(5)换一个新的消毒过的1.5ml离心管。

(6)将50~100μl DNA样品加到Sephedex G50表面。

(7)3000转/分,离心4min。收集离心出的DNA溶液,DNA可以用荧光仪作定量测定,也可通过凝胶电泳进行浓度估测, DNA稀释到2~3ng/μl。分装在显微注射的0.5ml离心管中,在-20℃或4℃下保存。

(8)注射前12000×g 4℃离心60min,上面1/3体积的DNA用于注射。

3注射用DNA应注意的问题

1.线性DNA比超螺旋DNA整合效率高。

2. DNA片段长度不影响整合频率。

3. DNA浓度1.0~3.0ng/μl之间产生阳性小鼠的频率最高。

4.黏性末端DNA比平末端DNA整合效率高。

5.DNA注射雄原核比雌原核效率高。

2.3小鼠的超排卵

2.3.1小鼠品系与年龄的确定

BALB/c和改良的BALC/c品系一般在12周龄具有较好的超排卵效果。而C57/6、BL/10、FVB、ICR等品系在3~5周龄具有较好的超排卵效果。

2注射量

用1ml或3ml注射器接26号针头,在小鼠腹腔注射2.5~10U PMCG(宁波激素厂),视品系而定。一般在下午4点钟实施注射,48h后,用同样型号的注射器注入10U HCG(宁波激素厂)。注射后与雄鼠合笼。

2.3.3受精卵的收集

第二天上午9点前检查阴栓,有阴栓的小鼠用来做受精卵的收集。

1.有阴栓的小鼠进行安乐死后切开中背部腹侧,获取输卵管(带小部分子宫)。

2.将输卵管移至干净的平皿中,用充满5ml无血清培养液的5ml注射器(26号针头),从子宫端刺入子宫角,用镊子夹住子宫端,缓缓注入5ml培养基。

3.另一个子宫角重复同样的操作,受精卵在培养基的压力下,从输卵管的切口处冲出。

4.用无菌的巴氏移液管把卵丘移至3ml加透明质酸酶的培养液中,消化至卵周围的卵丘细胞被消化,透明带上无细胞碎片黏附。再用移管把卵移至没有透明质酸酶的培养基中,将卵洗一次,在体视显微镜下进行观察,因受精卵排出第二极体,所以未受精卵和其他变成异常形态的卵可以很容易地进行区别。选好的受精卵,移到塑料皿(直径35mm)里并用矿物油(胚胎级:SIGMA)覆盖着的培养液液滴之中,在二氧化碳孵箱(37℃,5%二氧化碳)中培养直到用于显微注射为止(约从11:30~13:30)。显微注射的最佳时机是从卵膜周质辨认出雄原核到第一次卵裂前,雌雄原核刚要融合之时,一般注射最佳时段为3~4h。

5.为了检验注射效果,可以对注射过的卵进行体外培养,观察二分裂的比例。

2.3.4输精管结扎公鼠的制备

1.选4~6周健康雄鼠(一般用ICR),进行麻醉。

2.用70%乙醇消毒。

3.在中腹正中作10~15mm皮肤切口,切开腹壁肌肉,从两侧可以发现睾丸,用钝镊子夹住睾丸脂肪垫,向外牵拉,显露出输精管,结扎、灼烧或切去15~25mm均可,两侧睾丸复位后,用可吸收的手术线缝合。

4.手术后10d,同雌鼠交配,通过统计阴栓数,评估手术后雄鼠的交配能力。

2.3.5 DNA的显微注射

通过微分干涉显微镜观察受精卵,就会看到两个大的原核在直径约为100μm的卵中,原核大的时候,能达到20μm。注入DNA溶液要在原核期核膜清晰可见的时期进行。两个原核分别来源于精子和卵子。而通常来自精子的雄性原核较大。因此,雄性原核要比雌性原核能容纳更多量的DNA溶液,一般都是向雄性原核注入DNA溶液。

将注入DNA用的玻璃针装到右手的操作器上,将持卵管安装在左手的操作器上。以石蜡油充满管中,缓慢地使操作器的注射筒成为正压,当尖端有培养液溢出即可停止。另一方面,注入用吸管可直接安装充满石蜡油的管。

接着在载玻片上加上覆盖有矿物油的培养液滴。固定在倒置显微镜的载物台上,先将持卵的吸管推进视野。接着,在另外的载玻片上作成约有20个左右受精卵的培养液滴和DNA溶液滴,固定到载物台上。

将DNA溶液滴移进视野,DNA注入用玻璃吸管的尖部要调整到视野中心部位。通常,吸管内是正压,稍使压力降低,使其接近负压的时候,继续使操作器的注射筒内压力降低,则DNA溶液就吸进到吸管中。吸入量要以DNA溶液和矿物油之间出现的弯月形位置为准,一般距尖端1mm为好。

当吸完DNA溶液,将吸管退出DNA溶液滴。同时移动载物台,将吸管位置放到视野中心。移动载物台,使注入用吸管进入含有受精卵的培养液中,然后落下持卵吸管。视野里如有两支吸管和受精卵进入,则以持卵吸管将受精卵一个一个地加以固定,每固定一次就要将显微镜倍率加以提高(接物镜10~14倍;接目镜为15倍),将DNA溶液注入雄性原核。为了确定是否已经注入,须用眼睛确定雄性原核是否膨大。注入用吸管因不洁而多有尖端堵塞的情况。即便稍有堵塞也必须更换。而且,2μm以上的尖端会使受精卵核受到物理损伤,进而会妨碍小鼠的发育,故而不可用做实验。即使完全达到上述要求,也会有约20%的操作卵受到物理性破坏。仅仅吸管稍微大些,就会损坏约40%~50%,制作工具的好坏与实验结果的优劣紧密相关。

仅将未损坏的完成操作的卵收集起来,在二氧化碳孵箱(37℃)中培养一夜。第2天,将发育成2细胞的卵选出来,移植到假妊娠小鼠输卵管中。发育成2细胞的卵可达60%~80%。

2.3.6妊娠小鼠移植

注入DNA之后,立即移植,或者待其发育成2细胞的卵时(次日晨)移植到假妊娠雌小鼠的输卵管中。

4导入基因的鉴定

生育的仔鼠之中,转入基因阳性者,约占全部仔鼠的20%~30%。可以用Southern印记法(Southern blot)或PCR法对鼠尾DNA进行分析,以此对转基因小鼠进行鉴定。

用剪指(趾)法或文身法进行个体标记。将各个仔鼠尾巴切下1cm,从鼠尾提取DNA,用蛋白酶K和链酶蛋白E,50℃消化过夜,用酚一氯仿法或DNA提取试剂盒提取DNA。

在判定是否有导入基因之后,立即将转基因小鼠另行饲养,对不用的小鼠进行处理。

2.5 PMSG、HCG的配制方法

PMSG,1000U溶解在20ml生理盐水中,浓度为50U/ml,每只注射2.5~10U。

HCG,1000U溶解在20ml生理盐水中,浓度为50U/ml,每只注射4~10U,视小鼠品系而定。

2.6检查阴栓的方法

合笼后的次晨检查阴栓。用手的中指、小指和拇指捏住雌鼠尾根处,使小鼠头部向下,交尾过的雌性小鼠可看到有白色橡皮擦状的栓。经过激素处理的雌性小鼠交尾率为75%~90%。

2.7颈椎脱臼法

以右手紧捏小鼠尾部于笼具盖铁网上让小鼠抓住。慢慢地提起尾部将后肢悬起来,仅让小鼠前肢向前用劲。这时用左手的拇指到中指按压小鼠颈部,将其固定。右手拉尾,要迅速把颈椎拉断。使用这种方法牺牲动物时,关键是在最短时间内使动物失去知觉,动物感到的痛苦减到最小。如果是大批量地处理动物,应该使用CO2窒息法。

2.8显微操作仪使用规程

1.电源开关置于“ON”,将亮度调节至6。

2.将载物平台推后复位,转动换镜转盘,将10倍物镜送入光路,聚光镜调至MCL。

3.旋转显微操作仪的三维旋钮,使之分别置于刻度中间位置。

4.把注射器及金属凹槽一起取下,摘下针头式油管,旋转吸取液体石蜡,将气泡赶出,接好油管,安在固定架上,赶走油管及持针管中气泡。

5.将注射针和持卵管分别安装到持针杆上,左侧接持卵管,右侧接注射针。

6.聚光镜要和物镜一致,即使用10×、20×、40×物镜时,聚光镜调至MC1、MC2、MC3位置。低倍镜观察,高倍镜下显微注射。

7.显微注射操作完毕将物镜头旋开,前拉载物台将注射器、持卵管取下。

8.将显微操作仪三维微调旋钮调至“0”以外。

9.调低光亮度将电源开关置于“OFF”。

【注1】假妊娠小鼠的制作方法

用结扎了输精管的雄性小鼠与发情期雌性小鼠进行交配,交尾虽然成立(以阴栓来认定)但未引起受精,然而能够获得黄体活化并继续妊娠的雌性小鼠。这种小鼠称作假孕雌性小鼠。将卵移植到这种鼠的体内,可以受孕。一般用ICR作为假妊娠小鼠。

【注2】将操作卵移植至输卵管

用戊巴比妥钠将假妊娠小鼠麻醉,剃去脊背中央偏尾侧的毛,切开约1cm大的开口。用剪刀剥开皮肤和肌层。从外边可看到附着在卵巢上的白色脂肪。用剪刀剪开约5mm的切口。用镊子夹住脂肪将卵巢拉出(应尽量减少对卵巢的损伤),输卵管就会跟着露出体外。在充分将输卵管拉出来的部位,以止血钳夹住脂肪,并以其重量将输卵管固定。在倒置显微镜下,直径约150~250μm的玻璃管里吸进约12个操作卵,切开输卵管伞的上部将吸管插入进行移植。即便合计移植约24个卵,良好时也只得到8个,这是因为 DNA注入造成的损伤会使相当多的受精卵在中途停止发育。

【注3】移植用吸管制作

将微量红细胞比容用玻璃管以煤气燃烧器加热拉长之后,将外径为200μm的部位用安瓿刀切断,以镍合金线加热器将尖端加热,将棱角变成钝圆,再于距尖端3mm处弯曲成30°之后,在巴斯德吸管尖部以石蜡油来固定。

【注4】小鼠剪指(趾)标记法

国际认证的实验室不提倡小鼠剪指(趾)标记法(图2.1),要使用这种方法要求小鼠年龄不超过14天,并且要喷雾局部麻醉。比较流行的方法是在小鼠的尾部文身编号,这种设备已经有商业供应。

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