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实验方法

帕金森综合征

2019年07月01日 浏览量: 评论(0) 来源:《常见人类疾病动物模型的制备方法》 作者:秦川 责任编辑:yjcadmin

1 6-羟基多巴胺模型

【操作步骤】目前常用单侧损毁模型。选用体重200~300g SD或Wistar大鼠,戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔注射麻醉,固定于立体定位仪上,颅骨钻孔,8μg 6-羟基多巴胺(6-OHDA),溶于2μl生理盐水(其中含2g/L维生素C),微量注射于一侧黑质或内侧前脑束,注射完毕留针5min再缓慢拔出,封闭伤口。一般注射后24h出现多巴胺(DA)能神经元变性,2~3d后出现纹状体DA含量减少,成功的模型DA含量减少80%~90%。行为方面表现为身体向损毁侧偏斜。注射靶点也可选择单侧纹状体,在数周内逐渐引起黑质一纹状体DA系统逆行性变性,可部分模拟DA能神经元渐进性变性的特点。饲养12~14d后可外周注射苯丙胺或阿扑吗啡检验损毁效果,前者可引起大鼠向损毁侧旋转,后者则可使大鼠向损毁对侧(健侧)旋转。记录用药后30min的旋转次数,可作为帕金森综合征(Parkinson disease, PD)症状的定量指标。一般连续4周用阿扑吗啡诱发旋转次数保持稳定,即表示损毁作用已达稳定,可供实验之用。

【结果分析】6-OHDA单侧损毁制备的旋转模型是目前用得最多的PD模型之一,其病理、生化方面的表现同人类PD有不少相似之处,如黑质DA能神经元变性、死亡、缺失,胶质细胞增生,黑质和纹状体酪氨酸羟化酶(TH)活性及DA含量降低。另一突出的优点是药物诱发的旋转行为的量化,是评价抗PD药物疗效稳定可靠的指标。缺点是该模型仍属急性损伤模型,不能模拟 PD慢性进行性病程特点,病理方面也与人类PD有一定差异(如无细胞内Lewy小体)。此模型可用于PD的发病机制及药物疗效判定、细胞移植治疗、基因治疗、神经保护治疗方面的研究。

2甲基苯丙胺模型

  【操作步骤】选用体重200~300g SD或Wistar大鼠,按体重10~25mg/kg皮下注射甲基苯丙胺(methamphetamine),1次/天,连续4天用药后可出现短暂活动过多,随之是定向运动及活动减少。4~5天后可有“幻觉样”行为,表现为颤抖、舔毛、咬皮毛。1周后检测即可发现黑质和纹状体中TH活性降低,DA含量减少,但黑质DA能神经元丢失不明显。

【结果分析】这一模型可模拟PD生化方面的改变,但没有明显 PD病理、运动行为方面的症状。可用于PD神经保护方面的研究。

3 1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶模型

1.猴双侧损毁PD模型

成年恒河猴(猕猴、松鼠猴亦可),按体重0.135~0.15mg/kg从下肢静脉注射1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1- methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine, MPTP),第1天3次,第2、3天每日2次。在2~4次注射后出现短暂海洛因样急性反应,表现为仰卧、瞌睡、间歇性闭眼、动作减少、重复点头、四肢伸展、头向后仰并向一侧旋转。1周后出现类似于人类的PD症状,如眨眼少,两眼凝视,动作减少,动作迟缓,肢体发僵,震颤,屈曲姿势,发音、吞咽困难等。少动、强直、姿势及步态异常在不同种系及个体之间有较好的一致性,但震颤表现有明显差异,恒河猴多为姿势性、动作性震颤,非洲绿猴有静止性震颤表现。抗PD药物如左旋多巴可改善上述症状。

2.小鼠双侧损毁PD模型

一般选10~12周龄,体重25~30g C57/BL小鼠,按体重30~40mg/kg腹腔注射MPTP,连续7d,于第6~7次注射后出现暂时性(2~3h)躯干震颤、竖毛、尾巴过伸、动作减少及爬杆试验障碍。

3.猫双侧损毁PD模型

成年家猫,按体重5mg/kg腹腔注射MPTP连续5d,于第2次注射后每次注射时可见短暂海洛因样毒性反应,如瞳孔散大、流泪、流涎、凝视、活动异常等。在首次注射后次日起逐渐表现出表情呆滞、两眼凝视、瞬目减少、低头弓背、发音低弱、活动减少、动作笨拙、进食困难等PD症状。

4.猴单侧损毁PD模型

恒河猴,按体重0.15~0.17mg/kg一侧颈内动脉注射MPTP,1周后出现损毁对侧肢体活动减少,以及自发性向损毁侧转身。腹腔注射苯丙胺诱发向损毁侧快速旋转,注射阿扑吗啡后向损毁对侧快速旋转。利用MPTP制备的灵长类PD模型,在症状及病理、生化改变方面均酷似人类PD,而且稳定可靠,对抗PD药物的反应(包括副作用)也同人类相似。这是目前所建立的最能反映人类PD特征的动物模型,因而被广泛用于PD发病机制、诊断及治疗方面的研究工作中。费用高和管理不便是其缺点,尤其是双侧模型因进食、饮水困难,常需要应用抗PD药物才能保证其长期存活。 MPTP诱发小鼠、猫的PD模型在症状方面不及灵长类模型典型,但由于经济方便,也常被采用。MPTP在其他动物诱发的PD模型应用不多。

4鱼滕酮模型

【操作步骤】选Lewis大鼠,体重300~350g,戊巴比妥钠按体重50mg/kg腹腔注射麻醉,将渗透微泵埋入背部皮下,从下颌角静脉插管并将插管与微泵相连接,每日按体重2~3mg/kg灌注鱼滕酮(rotenone)(溶于1:1的二甲亚砜/聚乙二醇溶液中),每周更换1次微泵,连用5周。可选择性引起黑质一纹状体DA系统变性,在黑质细胞内有类似Lewy小体α-synuclein阳性包涵体形成。行为方面有屈曲体姿、运动减少,有时伴强直、震颤。

【结果分析】制备模型的神经毒素来自自然环境,其慢性暴露的制备方式能较好地模拟PD发病过程,在病理、生化、致病机制、行为等方面均能较好地模拟PD相关特征。该模型对研究环境因素与PD病因及发病机制之间的关系具有独特的价值,其慢性、进行性病程特征还特别适合PD的神经保护治疗研究。缺点是制备过程费时、费力,不同个体制备效果不一(有些动物无明显毒性效应)。另外,由于是双侧病变,其PD症状使饲养较困难。

5 PD遗传模型

PD多数为散发型,在PD人群中有少数的家族性PD病例,其遗传因素起关键作用,目前至少已发现两个家族性PD致病基因,包括α-synuclein和Parkin。可表达与PD发病有关的野生或突变基因的转基因动物,可作为PD遗传模型,用于相关致病基因的致病机制、环境因素与遗传因素的相互作用等方面的研究。目前已制备成功的PD遗传模型主要有α-synuclein转基因小鼠和转基因果蝇。高表达人类α-synuclein的转基因小鼠具有PD的部分特征,如纹状体DA神经末梢丢失,在胞浆有α-synuclein和ubiquitin阳性的包涵体形成,运动功能障碍。这些转基因小鼠包涵体与人类Lewy小体有差别,主要表现在缺乏纤维样结构特征。有时在细胞核内也可见到包涵体,这与人类PD明显不同。一些转基因小鼠只有包涵体形成和运动功能障碍但无DA能神经元变性,这些小鼠脑干运动神经元病变更明显。还有一个现象是野生型与突变型转基因小鼠病理改变基本一样。

α-synuclein转基因果蝇具备PD的一些重要特征,包括DA能神经元缺失、神经细胞内包涵体形成、运动功能障碍等。由于果蝇的遗传规律研究较透彻加上寿命较短,这一模型对了解某些新蛋白在PD发病机制中的作用有重要价值。

6偏侧部分损伤性帕金森病模型

【操作步骤】经检疫的健康成年恒河猴,年龄3~13岁,体重3.0~6.0kg,最小额宽与颅高均大于40mm,面角大于100℃。立体定向仪采用日本成茂(NAR2ISHIGE)SN22型。配制6-OHDA溶液,浓度为2mg/ml,以氯胺酮8mg/kg肌肉注射,再以戊巴比妥25mg/kg腹腔注射麻醉,阿托品0.11~0.115ml(0.15mg/ml)肌肉注射,肌松剂0.12ml(Bayer公司出品,猫、犬用)肌肉注射。头部固定后,剃去猴头顶部毛发,碘酊消毒并铺巾。正中矢状线向右旁开5mm,以耳间线前7mm为中点,作长约2cm的矢状切口。将头皮和骨膜向两侧牵开。用颅钻钻出-8mm直径的骨窗。立体定向仪校正0点后,以Hamilton微量进样器每次抽取10μl溶液(含6-OHDA 20μg)以A(0点前方)710mm、R(0点右侧)310mm、H(0点下方)0.15mm为中心共7个靶点注射,每次注射时间为5min,留针8min,出针时在前10mm内每次出针1mm,停留20s,10mm后稍快。注射结束后,头部伤口以3%双氧水和庆大霉素生理盐水冲洗,缝合骨膜和头皮。庆大霉素1mg肌注。

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