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实验方法

记忆减退和痴呆

2019年07月03日 浏览量: 评论(0) 来源:《常见人类疾病动物模型的制备方法》 作者:秦川 责任编辑:yjcadmin

1四血管阻断模型(4-VO)

【操作步骤】成年SD或Wistar大鼠用10%的水合氯醛(5ml/kg)腹腔麻醉后,背侧颈正中切口,暴露双侧第一颈椎横突翼小孔,用直径为0.5mm的电凝针插入双侧翼小孔烧灼双侧椎动脉,造成永久性闭塞。然后腹侧颈正中切口,分离双侧颈总动脉,穿线备用。24h后,用微动脉夹夹闭双侧颈总动脉5min,共夹闭3次,每次间隔1h。术后手术部位施以适量青霉素,然后缝合,常规饲养观察。

【结果分析】此模型成功率高,病理损伤接近人急性脑缺血的变化,致前脑缺血严重,但脑干部分由于有脊前动脉供血尚能维持,缺血后生理指标稳定,不影响缺血后结果。检查缺血成功与否的指标明确,可用于再灌注损伤研究。海马损伤明显,可显示记忆功能的减退;病理改变较为明确,无明显肢体运动障碍,是目前国际公认的血管疾病(VD)造模方法。但手术较复杂,存活率相对较低,对实验操作者的手术熟练程度要求较高。

2立体定向光化学诱导脑梗死模型

【操作步骤】成年SD或Wistar大鼠用10%的水合氯醛(5ml/kg)腹腔麻醉后固定在立体定位仪上,从尾静脉注射玫瑰红B-生理盐水溶液(RB,20mg/kg)。然后切开局部头皮暴露颅骨,用光导纤维引导冷光定向照射裸露的颅骨20min,照射部位即产生局部梗死灶。

【结果分析】由于RB受特定波长的冷光照射激活,释放自由基,导致血管内皮细胞发生脂质过氧化反应,引起血管内皮损伤,同时白细胞等被激活,启动局部血凝系统,从而引起局部血管内皮血栓形成。因此,该方法梗死部位明确,操作简单,手术创伤面小,重复性好,功能障碍明显,动物存活时间长,而且病理改变和超微结构变化与人类血管性痴呆相似。

3高脂血症血管性痴呆大鼠模型

【操作步骤】成年SD或Wistar大鼠用高脂饲料(40%脂肪、5%胆固醇、丙硫脲嘧啶、胆碱和胆酸钠)喂养1个月后,测其血脂,经证实已增高后,再用10%水合氯醛,按4ml/kg腹腔麻醉,颈正中去毛,碘酒消毒,腹侧颈正中切口,暴露并分离双侧颈总动脉,穿线备用。缺血时闭阻双侧颈总动脉3次,每次10min,每次间隔10min,之后缝合伤口即制成高脂血症VD模型。

【结果分析】此法是模拟VD发病的危险因素——高脂血症,而建立的一种动物模型,接近人类实际情况。

4舌下静脉注入铁粉法缺血梗死模型

【操作步骤】成年SD或Wistar大鼠用10%的水合氯醛(5ml/kg)腹腔麻醉后固定在立体定位仪上,然后固定于动物大脑立体定位仪上,常规消毒,正中切开头皮暴露颅骨,额部位于前囟前2mm向左旁开2mm,参考电极位于远额窦。在上述部位用小螺丝固定于头骨上,穿过内板障,在额部记录电极处正后方固定一直径为5mm、2000高斯磁场的小磁铁,最后用自凝牙托水和牙托粉封固。术后3d,等刀口愈合、体重恢复后,开始进行迷宫及P300测试。将已达迷宫训练标准并完成P300测定的实验大鼠用2.5%硫喷妥钠(4mg/kg)腹腔注射麻醉,用Fe3O4粉(广州磁性材料化工厂出品,铁粒子直径为6μm,用量56.4mg/kg)溶于1.5ml生理盐水中,于1min内沿大鼠舌下静脉注入,从而造成VD大鼠模型。

【结果分析】该模型操作简单,可重复性强,术中不必开颅,适于慢性实验,缺血部位较局限。缺点:此模型仅模拟了单一部位(额部)的缺血梗死,至于可否用于其他区域梗死与痴呆症的关系研究尚需进一步探索。

5高血压脑卒中自发大鼠动物模型

1963年,Okamoto和Aoki利用选择性近亲交配法从Wistar Kyoto鼠(WKY)分离出具有持久性血压升高的大鼠品系,并以兄妹交配维持,即为现在的SHR品系(自发性高血压大鼠),1974年Okamoto与Yamori等人从SHR中分离出一亚系为自发性高血压脑卒中倾向大鼠(SHRSP)。此亚系中80%超过100日龄雄性大鼠和60%超过150日龄雌性大鼠发生脑出血。因此可从脑出血后存活的大鼠中筛选VD模型大鼠(可在斯莱克实验动物中心购得)。

【结果分析】此模型有学习、记忆功能的减退,而且大脑皮层和海马区的乙酰胆碱和胆碱水平比对照组Wistar大鼠明显下降,这可能与学习记忆功能有关。在SHRSP中,血黏度、血细胞容积比和纤维蛋白原发生变化且均可产生血栓从而诱导脑梗死,这些病理组织变化同人类脑血管疾病非常相似。

6去大脑皮层VD动物模型

【操作步骤】Wistar大鼠用10%水合氯醛(4ml/kg)腹腔注射麻醉后剪开大鼠头部皮肤,暴露颅骨,用牙科钻在左侧颅骨钻6个孔并翻开颅骨,暴露左侧脑硬脑膜,用虹膜剪剪开硬脑膜,暴露软脑膜,在解剖显微镜下用蘸生理盐水的棉签轻轻擦拭,至软脑膜下见不到血管为止。

【结果分析】此模型病理改变以皮层损害最为首要,术后动物出现明显的学习记忆功能损害,在组织病理染色中,皮质、海马、丘脑等处细胞结构明显遭到破坏,细胞数量明显减少,细胞变性萎缩,充分模拟了VD的病理改变,是研究VD较理想的动物模型。缺点:在打开硬脑膜的同时也打开了蛛网膜下腔,会损及脑脊液;有可能损及硬脑膜窦引起大量出血而导致动物死亡。

7 IBO诱导的学习记忆障碍动物模型

【操作步骤】将IBO(α-amino-3-hydroxy-5-isoxazole acetic acid, Sigma Chemical St. Louis, MO, USA)溶于0.1mol/L pH7.4 PBS中,配成浓度为0.06mol/L的溶液。将配制完成的IBO以小量瓶分装,并保存在-80℃的冷冻冰箱中,用时取出解冻,并保持于冰中使用。

体重200~300g 2月龄的SD大鼠作为实验动物。大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(4ml/kg),置于立体定位仪上(stereotaxic instrument, David Kopf),调整两耳及前牙的位置加以固定,用手术刀剔除头皮上的毛发,经75%乙醇消毒后,从头皮中线切开,露出头骨。从头骨的前囟后面2.3mm处(即NBM核的位置),注入IBO(0.06mol/L,0.5μl)或PBS溶液(0.5μl)。注射时将针头先静置5min,让脑内部压力与外界压力达到平衡时,再将IBO于5min内慢慢注射完毕。经5min后,让IBO缓缓渗入 NBM核,避免因急速抽出针头而使IBO逆流出来。3%硫喷妥钠麻醉(40mg/kg),麻醉后固定在立体定位仪上,由尾静脉注射3.5%四氯四碘荧光素二钠(虎红,分子量为1017.63,上海试剂三厂,20mg/kg),1分钟后用光导纤维引导冷光,定向照射颞叶中回,光照20分钟。

【结果分析】颞叶梗死引起学习记忆障碍的机理迄今尚不清楚,此研究提示以下可能:颞叶梗死的大小与记忆及学习损伤的程度密切相关;颞叶与海马存在直接联系;颞叶病变可能引起谷氨酸和 CABA能神经功能障碍,进而引起学习记忆障碍。

8多发梗死性痴呆(MID)动物模型

【操作步骤】SD大鼠,10~12月龄,体重380g。取同种大鼠无菌干燥血凝块,研碎后用200μm筛孔过筛,应用时用生理盐水0.3ml加血凝块100mg制成混悬液,显微镜下测量直径40~200μm。10%水合氯醛(4ml/kg)腹腔麻醉,颈正中切开皮肤,剥离胸骨舌骨肌、肩胛舌骨肌与胸骨乳突肌,暴露颈总动脉、颈外动脉与颈内动脉,暂时夹闭颈总动脉,于左颈外动脉逆行插管注入栓子溶液0.3ml,立即结扎颈外动脉,同时开放颈总动脉,使栓子通过颈内动脉进入颅内至大脑各动脉,造成多发性脑梗死。分别于术后10天和20天用迷宫对大鼠的学习记忆进行测验;于双侧颈内动脉推注栓子悬液,方法剂量同上。

【结果分析】此法对Kaneko和陈氏方法加以改进,首先在注入栓子同时,开放颈总动脉,并在不少于30秒的时间内缓慢注入栓子,使之随血流广泛分布于脑内各区域,以期更接近临床。另外,减少注入栓子溶液量至0.3ml。这两方面保证了造模后48h内死亡率控制在10%~15%以内。尽管对这类模型的综合评价是梗死部位不固定,梗死灶大小不一致,但由于其能在大脑前动脉和大脑中动脉供血区形成多个梗死灶,且与临床上多发性脑梗死痴呆(multi-infarct dementia, MID)病人所见相似,故不少学者认为将其作为VD模型较为合适。本模型也存在不足:(1)栓子在进入颅内动脉的同时也进入翼突腭动脉,造成颅外梗死。(2)术后结扎了颈外动脉。

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